新型冠状病毒疫苗的研究进展

邓凯丽 舒磊 魏静 陈晓林 冯旰珠

南京医科大学附属逸夫医院呼吸内科211100

新型冠状病毒肺炎 (COVID-19)暴发流行对全球公众健康构成了严重威胁。COVID-19患者与2003年严重急性呼吸综合征和2012 年中东呼吸系统综合征患者症状相似,表现出一系列包括干咳、发热、头痛、呼吸困难等症状,病死率达3%～5%[1]。截至2021年3月28日,全球超过1.2亿人确诊COVID-19,273万人死亡,同时该病给全球带来严重的经济损失[2]。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndro me coronavirus 2,SARS-Co V-2)隶属冠状病毒β属,由日冕状包膜和单链RNA 基因组组成。基因组RNA 和核蛋白 (N)被埋在磷脂双层中,包膜结构蛋白主要包括基质蛋白 (M)、病毒包膜 (E)和刺突蛋白 (S),M 蛋白和E蛋白位于S蛋白之间,在病毒装配中起重要作用[3]。S蛋白介导病毒与细胞膜的融合,与病毒入侵的毒力有关,是诱导机体产生细胞免疫和体液免疫的主要抗原成分[4]。在当前COVID-19大流行趋势下开发疫苗就是人类和病毒之间的赛跑,许多国家都加快了疫苗临床试验的研究进程。目前约有268 种候选疫苗在世界范围内研制,包括灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗 (mRNA 疫苗和DNA 疫苗)、重组亚单位疫苗等。截至2021年3 月底,已有84 种SARS-Co V-2 疫苗处于临床研究阶段[5-6],本文就SARS-Co V-2疫苗研究进展进行如下综述。

1 灭活病毒疫苗

灭活病毒疫苗是一种传统的疫苗生产方式,即采用化学方法 (如甲醛溶液、β丙内酯或焦碳酸二乙酯)或放射线照射方法使病毒基因组失去感染性,同时保留抗原性,消除了潜在的感染力。灭活疫苗的开发和生产策略是一项常规和成熟的技术,相较于其他类型疫苗能提供更全面的保护作用,同时具有更高的安全性。目前临床使用的流感病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗均属于纯化灭活病毒疫苗。但灭活疫苗保留了病毒的全部蛋白,其成分相对复杂,可能会引起不良反应。

秦川、高强等多个科学团队联合研发了一种纯化灭活SARS-Co V-2候选疫苗 (Pi Co Vacc),研究人员使用β丙内酯进行病毒灭活后进一步纯化制备为待用疫苗[7]。最初在小鼠和大鼠体内进行d0和d7双剂免疫,Pi Co Vacc免疫后的小鼠血清中S蛋白特异性抗体是恢复期人类血清中的10倍,表明Pi Co Vacc具有诱发强力有效免疫反应的潜力。研究者进一步在恒河猴体内进行免疫接种以评估Pi Co Vacc的免疫原性和保护效力,d0、d7 和d14 三剂肌肉接种免疫,d22进行气管内攻毒,d29收集标本。恒河猴体内S蛋白特异性Ig G 和中和抗体均在第2周被检测到,并在第3周继续增加,抗体滴度与恢复期人类血清水平相似;气管内攻毒后,高剂量组 (6μg)恒河猴感染后的第7 天,咽喉、肛门和肺部均未检测到病毒;中剂量组 (3μg)感染后第7天,咽喉、肛门和肺部标本中部分能检测到病毒斑点,但与对照组相比病毒载量降低了约95%,且对照组的恒河猴肺部表现出严重的间质性肺炎,而免疫组肺部组织病理变化明显减轻。Pi Co Vacc能够在非人灵长类动物中诱发有效的免疫应答,并提供完全保护作用;接种了Pi Co Vacc疫苗的恒河猴体内未观察到抗体依赖的增强效应或免疫病理恶化及明显的发热、体质量下降等不良反应。

Wang等[8]共同参与研制的灭活候选疫苗BBIBP-Cor V也被证实具有较好的免疫原性及保护效力。其首先在小鼠体内分别进行单剂 (d0)、双剂 (d0、d7)、三剂 (d0、d7、d14)的腹腔接种,结果表明无论是低、中、高剂量组,三剂免疫接种方案所产生的抗体滴度均高于单剂和双剂免疫。研究人员进一步在猕猴、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠体内分别进行不同剂量 (2、4、8μg)的免疫接种,发现所有动物模型在免疫后21 d抗体血清转化率达到100%,同时没有观察到抗体依赖的增强效应和免疫病理损伤。恒河猴体内免疫-攻毒实验中观察到所有安慰剂组恒河猴在攻毒后整个评估期,咽拭子和肛拭子均维持较高的病毒载量;免疫组咽拭子和肛拭子病毒载量在攻毒后7 d均明显下降,部分未检测到病毒载量。在免疫组恒河猴的任一肺叶中均未检测到病毒,而安慰剂组在左、右肺均检测到较高的病毒载量,且病理组织学分析表现为严重间质性肺炎。为了进一步验证该疫苗安全性,单剂肌肉接种大鼠后连续观察14 d,并没有出现死亡事件或严重的不良反应,与安慰剂组相比较也没有明显的体质量下降或食欲下降,重要器官内没有观察到任何组织病理学改变。最长在猕猴接种后观察到36 d,同样没有出现明显的不良反应。

2020年9月多款灭活病毒疫苗相继开展Ⅱ/Ⅲ期随机、双盲、对照临床试验,结果均表明疫苗具有较好的免疫原性及安全性。灭活病毒疫苗于2020年底开始面向北京、武汉等地接受预约接种[9]。目前我国已全面开展全民疫苗接种工作,截至2021 年4 月13 日,各地累计报告接种SARS-Co V-2疫苗超过1.7亿剂次[10]。

2 减毒活疫苗

减毒活疫苗的成功应用具有悠久的历史,天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗等均属于减毒活疫苗,通过对病原体分子或结构蛋白的处理使其发生变异毒性减弱,但仍保留其免疫原性。减毒活疫苗的免疫过程与自然感染非常相似,且通常其免疫原性高于非复制性疫苗。

冠状病毒E蛋白参与诱导细胞内质网应激和宿主细胞炎性细胞因子过表达,从而导致肺组织损伤、水肿,并进一步发展为ARDS,缺少E 蛋白的冠状病毒由于装配失败和成熟缺陷,导致其存在形态和功能的异常。研究已表明冠状病毒缺少E蛋白可以减轻宿主细胞的应激反应,E 蛋白缺失减毒活疫苗可在小鼠和仓鼠上诱导产生体液和细胞免疫应答,而且可实现攻毒后部分保护作用[11-12]。

近年来,越来越多的研究表明卡介苗在呼吸系统和其它病毒感染 (黄热病毒和门戈病毒,与SARS-Co V-2一样都属于RNA 病毒)以及人体免疫强化中发挥重要作用[13-14]。有研究表明世界上部分未普及卡介苗接种的国家,如意大利和美国,SARS-Co V-2 相关的死亡率要高于长期普及卡介苗接种的国家 (如韩国和日本)[15]。目前在美国临床试验数据库平台注册的相关研究已有7项,其中4项正在招募试验者,主要针对一些高危人群,比如医护人员接种卡介苗能否避免感染SARS-Co V-2[14]。荷兰、德国、英国和澳大利亚也在进行相似的试验计划[16-18]。

3 病毒载体疫苗

将疫苗靶基因整合入载体基因组中制备成病毒载体疫苗,可以感染细胞并在细胞质内表达靶抗原,因此可高效诱导机体产生体液和细胞免疫应答,并且具有天然黏膜嗜性。通过鼻腔或口腔接种病毒载体疫苗还能诱导黏膜免疫反应,是近几年发展最为迅速的疫苗类型。但常用的病毒载体腺病毒是一种常见感冒病毒,人体通常存在预存免疫力,在一定程度上会削弱疫苗免疫效力。

陈薇团队使用一种减毒的普通感冒病毒 (腺病毒Ad5)将编码SARS-Co V-2 S蛋白的遗传物质传递给细胞,随后这些细胞分泌S 蛋白并刺激机体免疫系统产生抗体[19]。Ad5载体疫苗是第一个在人体上进行试验的SARS-Co V-2疫苗,Ⅰ期临床试验主要评估该疫苗的安全性及免疫原性,在108名18～60岁健康成人中进行不同剂量的单次肌肉注射,部分受试者表现出轻度或中度的不良反应,发生率为75%～83%。常见的不良反应包括注射部位轻度疼痛(54%,58/108)、发热 (46%,50/108)、乏力 (44%,47/108)、头痛 (39%,42/108)和肌肉痛 (17%,18/108),这些不良反应均可在48 h内自行恢复。在接种疫苗后第2周,所有剂量组都检测到一定水平的受体结合域(receptor binding do main,RBD)特异性抗体,部分受试者体内可检测到中和抗体 (低剂量组28%,10/36;中剂量组31%,11/36;高剂量42%,15/36),到第4 周中和抗体滴度出现了4倍增长,表明Ad5载体疫苗可以诱导一定程度的体液免疫反应。同时在高剂量组和中剂量组均检测到脾脏细胞释放的高水平γ-干扰素,意味着其同时可诱导较强的T 细胞免疫反应。在Ⅱ期临床试验中扩大样本量,入组508名受试者,并且由于COVID-19的重症率、病死率随年龄增长显著升高,Ⅱ期临床试验设计重点关注年长人群,最年长的84岁受试者也产生了较为理想的保护性抗体[20]。目前该疫苗已在全球三大洲五个国家的78 家临床研究中心开展了全球多中心Ⅲ期临床研究,在巴基斯坦的Ⅲ期临床试验中,单针接种疫苗28 d后,COVID-19重症病例保护效力达到100%,总体保护效力为74.8%。该疫苗采用单针免疫程序,可于2～8 ℃稳定保存,更易于运输和存储,在我国已获国家药品监督管理局附条件批准上市。

英国牛津大学Folegatti等[21]同样使用腺病毒作为载体开发了AZD1222 (Ch Ad Ox1 n Co V-19)病毒载体疫苗,装载编码全长S蛋白遗传物质。该试验共招募了1 077名18～55岁健康成人,其中543 名接种AZD1222 作为免疫组,534名接种脑膜炎共价疫苗Men ACWY 作为阳性对照组,2组均单次肌肉接种5×1010病毒颗粒;在免疫组中随机选取10例进行初免-加强免疫试验。该研究发现单次肌肉接种后体内产生S蛋白特异性T 细胞免疫反应,并在第28天达到高峰,初免-加强组T 细胞免疫反应高峰持续升高至第56天。在体液免疫反应监测中发现单次接种后第56 天,62%的受试者体内中和抗体可诱导产生完全抑制细胞病变效应;而10例接受初免-加强免疫受试者均可诱导产生完全抑制细胞病变效应。该研究表明在人体加强免疫能大大提高疫苗免疫效果,同时预防性使用非甾体解热镇痛药能够缓解疫苗接种引起的发热、疼痛、肌肉酸痛等轻、中度不良反应[21]。除了腺病毒载体,目前中国香港大学微生物学系以流感病毒为载体的喷鼻式疫苗正在基础研制中;武汉博沃生物科技有限公司和Geo Vax Labs共同研发基于改良型痘苗病毒安卡拉株为载体的MVA-VLP疫苗[22];美国Tonix公司正在开发基于马痘疫苗为载体的TNX-801 (经皮注射马痘病毒活疫苗)[23];法国巴斯德研究所正在研制以麻疹疫苗为载体的SARS-Co V-2疫苗。

4 核酸疫苗 (mRNA疫苗和DNA疫苗)

核酸疫苗属于目前最尖端的疫苗技术,其将含有编码抗原组分的mRNA 或DNA 直接或间接接种到受试者体内,通过受试者自身的蛋白表达系统合成抗原蛋白,最终到达细胞膜表面诱发针对该抗原的细胞免疫及体液免疫。DNA 疫苗具有制备简单快速的优势,但存在DNA 整合到宿主基因组的潜在安全性问题;而mRNA 不会整合到宿主基因组中,安全性更高,但其稳定性欠佳,如何有效进入人体细胞内并且不被分解是目前的技术难题。

美国国立过敏与传染病研究所正在研究的mRNA-1273是一种新型脂质纳米颗粒封装的mRNA 疫苗,编码一种预融合稳定状态的S蛋白[24]。研究团队共招募了45名18～55岁的健康志愿者,间隔28 d接受2次肌肉接种,超过一半的志愿者在首次接种后会出现疲劳、发冷、头痛、肌肉酸痛等自发性不良反应,但这些症状都属轻度或中度,并且是暂时性的,可自行恢复。志愿者在接种第一剂疫苗后体内便会产生抗体,疫苗接种剂量越大其抗体滴度越高,但要在接种第二剂疫苗后才能表现出显著的免疫反应。研究者进一步通过伪病毒中和测定法和实时噬菌斑减少中和试验以评估抗体的中和活性[25]。目前mRNA-1273的Ⅱ期临床试验已完成,增加剂量至100μg,同时受试者年龄范围扩大至18～55岁、56～70岁及大于70岁人群后均得到较为满意的实验结果[26]。

英国帝国理工大学Shattock 团队开发了自放大RNA纳米疫苗[27]。自放大RNA 是将病毒复制酶基因与S蛋白基因连接,在脂质纳米颗粒的递送下实现RNA 扩增的一种技术,这种脂质载体包裹RNA 的治疗方案由Gar ber[28]研究并获批,开创了脂质纳米颗粒-RNA 临床治疗安全性的先例。仅使用病毒的复制酶基因并不包含结构基因,不会产生病毒颗粒,具有较好安全性,但机体仍可能对复制载体产生免疫应答,因此就需要用脂质载体进行包裹模拟细胞膜结构,避免被机体免疫系统清除,同时提高免疫活性。研究人员通过双剂 (d0/d28)肌肉注射免疫小鼠,产生的Ig G1/Ig G2a抗体比例显示其主要诱导Th1型免疫应答,在小鼠血清中可观察到剂量依赖性特异性Ig G,最高达到105～106μg/L,通过假病毒中和实验进一步证明该疫苗诱导产生的抗体比恢复期人类血清具有更高的活性及保护效力。

Mulligan等[29]合作研发的核酸疫苗 (BNT162b1)已经完成Ⅰ/Ⅱ期临床试验,BNT162b1编码S蛋白的RBD,是一种脂溶性颗粒型核苷修饰mRNA 疫苗,通过添加T4纤维蛋白衍生的 “foldon”修饰,BNT162b1 表达的RBD抗原为三聚体化RBD,可以有效增强其免疫原性。通过肌肉注射双剂 (d0/d21)免疫小鼠,注射部位轻度至中度疼痛是最常见的局部反应,且呈现剂量依赖性,短时间内可自行恢复。该Ⅰ/Ⅱ期临床试验共纳入36名18～56岁志愿者,验证了该疫苗可诱导有效的体液免疫反应,加强免疫后血清抗体滴度可达恢复期人类血清的1.8～2.8倍。Walsh等[30]在此基础上进一步研究对比BNT162b1和BNT162b2(编码全长S蛋白)的安全性和免疫原性,纳入196名18～55岁和65～85岁健康成人,结果表明这两种候选疫苗具有相似的免疫原性,能够在体内产生剂量依赖性中和抗体滴度,而且BNT162b2的全身性不良发生率和严重程度均低于BNT162b1,尤其在高龄人群中较为明显。后续将更进一步开展Ⅱ/Ⅲ期临床试验进一步评估BNT162b2的安全性和有效性。

INO-4800是美国生物技术公司Inovio研发的DNA 候选疫苗[31],使用手持式智能设备CELLECTRA 从肌内或皮内将优化后的质粒经过一个简短的电脉冲,进入细胞并借助质粒DNA 来产生靶抗原,抗原进一步在细胞内自然加工触发细胞免疫和体液免疫反应。该DNA 疫苗的Ⅰ期临床试验招募40名18～50岁的健康成年人,在完成接种的36名受试者中有94% (34名)对接种疫苗产生免疫反应,观察至接种疫苗后第8周INO-4800展现出良好的安全性和耐受性,且试验中发生的所有不良事件均为轻度,大多数情况是注射部位发红。后续INO-4800的Ⅱ/Ⅲ期临床试验正在筹备中。

5 重组亚单位疫苗

亚单位疫苗由纯化的重组蛋白构成,选择病毒中目标抗原组分来制备疫苗,其不含病毒复制需要的核酸,因此安全性较高。与病毒载体疫苗的区别在于亚单位疫苗的合成与表达均在体外完成,其具有单纯的蛋白组分,可以通过鼻腔或口腔接种进一步诱导黏膜免疫反应,从而更有效地阻断病毒通过呼吸道传播,然而作为一种非内生抗原,亚单位疫苗不能通过MHC-Ⅰ递呈,因此其细胞免疫原性相对较弱,常需要合适的免疫佐剂共同发挥作用,提高其免疫原性。

RBD319-545疫苗是由四川大学科研团队开发,研究人员使用S蛋白的多个不同部位制备多款候选疫苗,筛选后选定RBD 中编号为319～545的一段氨基酸序列作为候选疫苗[32]。使用该疫苗单剂免疫7 d或14 d后,在小鼠、兔子和猕猴体内诱导有效体液免疫反应,免疫动物的血清在体外可阻断RBD 与细胞表面ACE2 结合,并中和SARSCo V-2假病毒和SARS-Co V-2活病毒的感染。四川三叶草生物制药有限公司采用其独有的Tri mer-Tag (蛋白质三聚体化)专利技术和基因重组的方法构建 “S-三聚体”重组蛋白疫苗基因表达载体,通过基因转染在哺乳动物细胞内表达、纯化,获得与冠状病毒天然表面抗原S蛋白构象高度相似的共价三聚体重组抗原 “S-三聚体”。该候选疫苗将使用疫苗佐剂系统和美国Dynavax公司的Cp G 1018 佐剂进行评估,全球Ⅱb/Ⅲ期疫苗有效性研究已进入准备阶段。

高福研究团队为了最大化RBD 结构域免疫原性,构建了RBD 的二聚体抗原,晶体结构显示二聚化的RBD 完全暴露了双受体结合基序,这也是中和抗体的主要结合靶标[33]。其研究团队通过进一步结构导向设计产生稳定的串联重复单链——RBD-sc-di mer,成功保留了疫苗的免疫效力。该疫苗成功在小鼠模型中诱导产生高浓度的中和抗体,保护小鼠免受中东呼吸系统综合冠状病毒感染,并进一步将该疫苗设计策略推广到严重急性呼吸综合征冠状病毒、SARS-Co V-2的疫苗研发中,为冠状病毒疫苗的研发提供了新的思路。高福院士表示:该疫苗设计策略灵活易变,可普遍应用于其他β属冠状病毒疫苗的设计中,从而应对未来可能出现的由冠状病毒引起的新型传染病。

美国Novavax 公司研制的重组亚单位疫苗NVXCo V2373是一种稳定的预融合重组蛋白疫苗[34]。它是利用基因工程使用昆虫细胞生产的SARS-Co V-2 S糖蛋白,由该公司自主研究开发的纳米颗粒技术制成。Tian 等[35]和Guebre-Xabier等[36]分别在小鼠和猕猴体内评估该疫苗的免疫原性及保护效力,结果表明低剂量 (5μg)的VXCo V2373双剂肌肉接种后便可产生较高水平S蛋白特异性抗体,同时可以阻断RBD 与ACE2结合。该疫苗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验首先在墨尔本阿尔弗莱德医院展开,131 名年龄在18～59 岁的健康志愿者报名参加了这项试验。Novavax表示,该试验的第二阶段预计将在包括美国在内的多个国家进行,评估更广泛年龄段参与者的免疫原性、安全性,以及降低COVID-19 疾病传播的可能性。此外,美国生物制药公司i Bio 和北京CC Phar ming 有限公司合作,利用Fast Phar ming Syste mTM植物工厂生产亚单位疫苗以应对SARS-Co V-2,该疫苗目前正在加速研发中。

6 总结与展望

SARS-Co V-2多种候选疫苗具有较好的安全性、耐受性和免疫原性。灭活病毒疫苗现已有序推进广泛接种,Ⅲ期临床试验数据表明其保护效力为79.34%,远高于WHO提出的不低于50%的标准,为SARS-Co V-2疫苗的进一步研发和临床应用提供了重要信息。

在SARS-Co V-2快速传播及药物选择背景下,病毒基因组结构发生变异。尽管S蛋白相对稳定,个别位点的突变对蛋白本身结构的影响较小,但病毒基因的不断变异一定程度上限制了SARS-Co V-2 疫苗的研制。因此,后续SARS-Co V-2疫苗的设计研发策略需要进一步调整,利用基因组学、分子生物学等技术设计更加成熟、稳定的疫苗,向着更加精准、长期、高效的为机体提供免疫保护效力发展。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突