马铃薯提取物联合放疗通过增加凋亡抑制结直肠癌细胞增殖的研究

宝莹娜 杨梅健 张继红 林宇 郁志龙 赵建国

研究发现，马铃薯提取物中含有丰富的抗肿瘤、抗炎症、抗氧化成分，能够抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖生长，诱导凋亡发生，具有重要作用［1-3］。本研究通过采用内蒙古本地马铃薯提取物联合放疗，以人结直肠癌细胞株为研究对象，进行细胞学研究，探讨马铃薯提取物联合放疗对结直肠癌细胞株的作用及机制。

材料与方法

一、材料

细胞系与主要试剂：人直肠癌LS-174T细胞株，购买于北纳生物公司；马铃薯提取物由内蒙古蒙健生物科技有限公司提供；DMEM培养基、胰蛋白酶购于Gibco公司；胎牛血清购于Hyclon公司。CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay购于Promega公司。兔抗人GAPDH多克隆抗体购于杰美基因公司；兔抗人Caspase-3单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购于Cell Signaling公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于BD公司。

二、实验方法

1.细胞培养：人直肠癌LS-174T细胞保持在高糖型DMEM完全培养基（含双抗）中培养，并辅以用含10%的胎牛血清，将培养瓶放置于37℃、5%恒定湿度的培养箱中培养，期间根据细胞生长情况予以换液、传代或者冻存。

2.细胞照射：所有的照射均在内蒙古医科大学附属医院放疗科加速器2室照射，应用德国西门子直线加速器6MV-X线，源皮距SSD=100 cm，96孔板照射野：100 cm2，培养瓶照射野：25 cm2。照射野大小为每次需照射的细胞的培养瓶底总面积大小。

3.MTS检测细胞增殖水平：将对数生长期的直肠癌LS-174T细胞消化离心后，加入1 mL DMEM完全培养基制成细胞悬液，用countstar细胞计数仪计算出细胞数，每孔接种5×103个细胞，取出适当细胞悬液加入适当体积DMEM进行稀释后接种于96孔板中，置于37℃、5%恒定湿度的培养箱中培养24 h使细胞贴壁后分别加入0 μL/孔、5 μL/孔、25 μL/孔、50 μL/孔浓度的马铃薯提取物，每个浓度设3个复孔，置于37℃、5%恒定湿度的培养箱中培养4 h使马铃薯提取物和人直肠癌LS-174T细胞充分作用。4 h后将96孔板在直线加速器下照射，不同浓度分别接受0 Gy/孔、2 Gy/孔、4 Gy/孔、8 Gy/孔剂量的射线照射，接受照射后将96孔板继续放入培养箱分别培养24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL MTS溶液，继续培养4 h后上机，酶免疫检测仪490 nm波长测定各孔吸光度值。按公式计算抑瘤率：（对照组A490-实验组A490）/对照组A490×100%。

4.流式细胞术检测细胞凋亡：将试剂盒内10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer，用预冷的PBS将细胞清洗2遍，重悬后按照1×106个细胞/mL的细胞浓度于每组细胞中加入适量1×Binding Buffer工作液，每组吸出100 μL上述溶液（含1×105个细胞）到5 mL的培养管中，每组细胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染液，轻柔吹打细胞，室温（25℃）避光孵育15 min，加入400 μL×Binding Buffer到每个培养管中，1小时内上机读取结果。

5.Western blotting检测蛋白：将细胞分为ABCD四组，分别为：A组：8 Gy照射＋1 mL马铃薯提取物；B组：8 Gy照射；C组：1 mL马铃薯提取物；D组：未接受任何处理。四组样品均在接受相应处理72 h后用配制的蛋白裂解液提取蛋白，上样，跑胶，转膜，封闭1 h，内参、Bcl-2及Caspase-3加入一抗稀释液，4℃摇床过夜，洗膜（TBST清洗3次，10 min/次），二抗孵育，室温，避光，摇床1 h，洗膜（TBST清洗2次，TBS清洗1次，10 min/次），上机扫描，使用ODYSSEY CLX近红外激光成像系统读取结果。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料两组数据比较进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、马铃薯提取物联合放疗能够抑制结直肠癌细胞的增殖水平

马铃薯提取物单独作用结直肠癌细胞株时，随着提取物浓度在25 μL/mL后，对于细胞增殖的抑制作用逐渐增加，特别是在浓度为50 μL/mL作用72小时后对细胞增殖的抑制作用最显著（t=28.6，P=0.001）（见图1）。马铃薯提取物联合放疗共同作用于LS-174T细胞，使其增殖水平受到更大抑制，在给予相同剂量的放疗作用时，当马铃薯提取物的浓度在25 μL/mL和50 μL/mL时对于增殖水平的抑制更加明显。当放疗剂量在8 Gy，同时马铃薯提取物浓度在50 μL/mL作用LS-174T细胞72 h后，对于结直肠癌细胞增殖的抑制水平达到最高（t=12.1，P=0.007，P＜0.05）（见图2～4）。

图1 马铃薯提取物单独作用对结直肠癌细胞增殖的影响（注：当马铃薯提取物浓度达到25 μL/mL后，结直肠癌细胞的增殖抑制，特别是马铃薯提取物浓度在50 μL/mL作用72小时抑制最明显，与对照组比较，*t=28.6，P=0.001）

图2 马铃薯提取物联合2 Gy放疗对结直肠癌细胞增殖水平的影响（注：马铃薯提取物50 μL/mL联合2 Gy放疗作用于LS-174T细胞，在24小时、48小时、72小时，分别与对照组相比，均对细胞增殖抑制，*t=7.0，P=0.02，**t=68.0，P=0.00，***t=39.4，P=0.001）

图3 马铃薯提取物联合4 Gy放疗对结直肠癌细胞增殖水平的影响（注：马铃薯提取物50 μL/mL联合4 Gy放疗作用于LS-174T细胞，在24小时、48小时、72小时，分别与对照组相比，均对细胞增殖抑制，*t=5.24，P=0.04，**t=17.5，P=0.003，***t=54.4，P=0.00）

图4 马铃薯提取物联合8 Gy放疗对结直肠癌细胞增殖水平的影响（马铃薯提取物50 μL/mL联合8 Gy放疗作用于LS-174T细胞，在24小时、48小时、72小时，分别与对照组相比，均对细胞增殖抑制，*t=9.39，P=0.01，**t=5.31，P=0.03，***t=12.1，P=0.007）

二、马铃薯提取物联合放疗诱导凋亡发生

通过对马铃薯提取物浓度为50 μL/mL联合8 Gy放疗作用的LS-174T细胞进行流式细胞仪检测，发现其凋亡水平显著高于对照组（t=18.3，P=0.003）（见表1）。进一步检测蛋白表达水平，证实在该组实验细胞中，Bcl-2表达水平受到抑制，而Caspase 3表达水平升高（见表2）。

表1 马铃薯提取物联合放疗对结直肠癌细胞凋亡水平的影响（±s）

表1 马铃薯提取物联合放疗对结直肠癌细胞凋亡水平的影响（±s）

注：马铃薯提取物50 μL/mL联合放疗8 Gy与对照组相比较，凋亡比例显著升高，*t=18.3，P=0.003

凋亡比例74.74±8.12*23.8±5.23 2.11±0.16 1.92±0.24组别马铃薯提取物50 μL/mL联合放疗8 Gy放疗8 Gy马铃薯提取物50 μL/mL对照组

表2 马铃薯提取物联合放疗在蛋白水平对结直肠癌凋亡的影响（±s）

表2 马铃薯提取物联合放疗在蛋白水平对结直肠癌凋亡的影响（±s）

注：Werstern blotting结果显示，与对照组相比较，马铃薯提取物联合放疗组Bcl-2表达显著降低，Caspase 3表达显著升高，*t=40.4，P=0.000，**t=10.1，P=0.001

0.0021±0.0001 0.0026±0.0002 0.002±0.0003组别马铃薯提取物50 μL/mL联合放疗8 Gy放疗8 Gy马铃薯提取物50 μL/mL对照组蛋白质含量Bcl-2 0.0038±0.0001*Caspase-3 0.0079±0.0004**0.0047±0.0002 0.0065±0.0001 0.0071±0.0001

讨 论

马铃薯（solanum tuberosum）在世界各国普遍食用，经证实其含有大量优质蛋白质、碳水化合物和矿物质，尤其是多种有益于人体健康的小分子化合物［4］。越来越多的研究表明，马铃薯中的化合物在抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等方面发挥着重要作用［5］。在前列腺癌研究中，发现马铃薯提取物中的酚酸和花青素能够抑制前列腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡，并且通过诱导MAPK和JNK通路实现细胞增殖的抑制作用［6］。在宫颈癌研究，对于Hela细胞马铃薯生物成分能够诱导S期细胞周期停滞，导致细胞增殖受到抑制［1］。肺癌研究中，马铃薯提取物α-茄碱，是一种在马铃薯中发现的配糖生物碱，对人肺癌细胞系具有细胞毒作用［7］。以上研究都证实了马铃薯提取物具有癌细胞生长抑制作用。放疗是结直肠癌的主要治疗方式之一，尽管目前结直肠癌的治疗效果相对较好，但是局部复发和放射抗性仍是需要探索的挑战。因此，本研究通过放疗联合马铃薯提取物两者结合作用结直肠癌细胞，为未来结直肠癌放疗增敏剂的研究提供实验资料。

在本研究中，研究了不同浓度马铃薯提取物对结直肠癌细胞的抑制能力。研究表明，在马铃薯提取物浓度为25 μL/mL和50 μL/mL时细胞的增殖抑制显著。当采用50 μL/mL马铃薯提取物作用72小时后明显抑制细胞的生长。前列腺癌的研究中表明，随着浓度增加，马铃薯提取物对前列腺癌细胞增殖的抑制作用增强［8］。

尽管在多种研究中证实，马铃薯提取物能够诱导不同癌细胞的凋亡，但是这些研究都未与放疗联合。本研究表明，当马铃薯提取物浓度大于5μL/mL并与放疗结合会降低结直肠癌细胞的生长水平。在相同剂量的放疗作用下，给予50 μL/mL的马铃薯提取物分别在作用24 h、48 h和72 h表现出最高的生长抑制作用。另一方面，结直肠癌细胞在8 Gy放疗联合马铃薯提取物50 μL/mL浓度中生长72小时，其增殖显着降低，这表明马铃薯提取物联合放疗对结直肠癌细胞增殖有较强的抑制作用。

为了进一步阐明机制，研究发现马铃薯提取物联合放疗能够诱导细胞凋亡发生，进而抑制细胞的增殖，与马铃薯在其他癌细胞系中的促凋亡作用一致［8-9］。同时研究表明，放疗联合马铃薯提取物能够使结直肠癌细胞中Caspase 3的激活和Bcl-2的失活。尽管如此，对于两者联合作用之后的机制仍需进一步深入研究。

综上所述，本研究已经明确马铃薯提取物联合放疗能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖，并与细胞凋亡的激活有关。本研究提供了一种新的研究方向，未来可以通过马铃薯提取物来增强对结直肠癌的放射治疗活性。