口腔白色念珠菌生物膜的形成、体内模型及耐药机制

郝伟锋 张荷钰 葛学军

作者单位：030001太原，山西医科大学口腔医学院·口腔医院[郝伟锋、葛学军（葛学军为通讯作者）]；北京大学口腔医院·中心实验室（张荷钰为共同通讯作者）

白色念珠菌是口腔中常见的共生菌，在维持口腔生态系和宿主之间的平衡发挥重要作用。当机体内平衡被某些因素破坏后，白色念珠菌由共生菌转为致病菌，尤其容易感染免疫力低下、黏膜完整性破坏及老年患者[1]。常用的抗真菌药物有唑类、多烯类、棘白菌素类与嘧啶类，但由于其广泛使用导致耐药性问题益发严重。本文就口腔白色念珠菌生物膜形成过程、体内研究模型、抗真菌药物及耐药机制作一简要综述，。

一、生物膜形成过程及体内模型研究

生物膜是由自身产生的大量细胞外基质包裹、附着于生物材料或人体组织表面的有组织的细胞群落[1，2]。白色念珠菌生物膜的形成过程为：①早期（0～11h）：0～2h，白色念珠菌主要以酵母相细胞黏附在生物表面，形成薄细胞层，细胞多分散存在；3～4h即有散在的微菌落形成。②中期（12～30h）：白色念珠菌进一步生长增殖定植在薄层细胞层表面，此时可见大量细胞外基质，游离菌落被基质逐渐包裹，聚集形成生物膜的基底层。③晚期（31～72h）：细胞外基质进一步积累，覆盖在菌落表面直至将细胞完全包裹，形成由酵母相细胞、假菌丝细胞、菌丝细胞构成的成熟三维网状生物膜。④部分白色念珠菌细胞从生物膜分离扩散到新的生物表面，促进远端部位的定植和建立新的感染部位[3，4]。由蛋白质（55%）、碳水化合物（25%）、脂类（15%）和核酸（5%）组成的细胞外基质为生物膜提供了完整的物理屏障，是成熟生物膜抵抗机械破坏的关键。菌丝作为支撑生物膜不同成分的支架，促进了生物膜结构的整体稳定性[5]。

由于口腔白色念珠菌生物膜形成的复杂性，多种可复制的体外模型被用来研究生物膜特性。但由于体外模型未能考虑宿主免疫防御、菌群和病原体的相互作用，因此体内模型应用而生，以便更好的模拟口腔白色念珠菌生物膜的致病情况。

Nett JE等[6]用雄性斯普拉-道来氏（SD）大鼠做义齿模型研究。SD大鼠在感染当天用单剂量的可的松（200mg/kg）进行免疫抑制，麻醉后于硬腭处固定8mm×10mm×2mm丙烯酸材料的义齿，并在义齿与硬腭之间留3～5mm间隙以便于接种白色念珠菌（1.0×108细胞/mL）。待培养不同时间段后，取出义齿进行组织病理学或形态学等检测。但是由于传统制作工艺的受限使义齿制作过程费时，对实验动物损伤大，装置与硬腭不能紧密贴合。这种情况不能准确地反映义齿佩戴者的感染发展过程[7，8]。最近，Sultan等[8]利用牙科三维数字成像和打印技术，仅对一只大鼠的上颚进行扫描便可精确制作出通用的SD大鼠口内装置，以便更好的研究真菌义齿生物膜感染情况。

Dongari-Bagtzoglou A等[9]以白色念珠菌SC5314感染6～8周龄的雌性C57BL/6小鼠，成功构建了口腔黏膜的体内模型。小鼠在感染前一天皮下注射醋酸可的松（225mg/kg）抑制免疫功能。麻醉后，用浸有菌液（6.0×108细胞/mL）的棉球擦拭小鼠口腔，并于舌下放置2h，连续3天。期间给予动物含有白色念珠菌悬液的饮用水，以保持较高的口腔菌载量。实验结束处死小鼠取出舌头，在共聚焦显微镜下观察舌头背面的白色斑块。最近Martinna等[10]用此模型进一步研究了白色念珠菌与口腔各种细菌的相互作用，并证实了白色念珠菌在黏膜生态方面调控的关键作用。此模型首次对口腔黏膜的白色念珠菌生物膜的结构和组成进行了系统的阐述，为探究白色念珠菌与口腔微生物菌群之间的生态平衡对真菌感染风险的调控机制提供了依据[9，11]。为了研究发病机制，Paolo等[12]对原有模型进行改良，使用转基因的生物发光白色念珠菌对感染进程、特定器官靶点进行实时监控。

二、抗真菌药物

口腔白色念珠菌感染的有效管理取决于多方面，包括早期的正确发现与诊断、纠正诱发因素和潜在疾病、根据感染严重程度选择合适的抗真菌药物[13，14]。但诱发因素或潜在疾病（如器官移植、艾滋病等）往往不能及时清除，此时抗真菌药物治疗显得尤为关键。目前常见的抗真菌药物根据化学结构与作用靶点可分为四类：抑制细胞膜成分麦角甾醇的合成（唑类）;改变细胞膜通透性，细胞内成分丧失（多烯类）;非竞争性抑制β-（1，3）-D-聚糖合酶，阻碍细胞壁β-（1，3）-D-葡聚糖合成（棘白菌素类）;干扰真菌RNA正常合成及DNA的复制过程（嘧啶类）。

1.唑类：唑类药物在口服和静脉中都具有良好的安全性和生物利用率，是临床中应用最广泛的抗真菌药。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成部分，羊毛甾醇在由Erg11调控的羊毛甾醇14α-去甲基化酶催化作用下生成麦角甾醇维持细胞的稳态。唑类药物通过与羊毛甾醇14α-去甲基化酶（细胞色素P450酶）的血红素基团中铁原子高亲和力结合抑制麦角甾醇生成，同时导致Erg3调控的毒性的甲基化羊毛固醇增加，从而诱发膜通透性改变，内容物渗透，细胞死亡[15，16]。常见的唑类药物有咪唑类（克霉唑、咪康唑）与三唑类（氟康唑、伊曲康唑）。与其他抗真菌药物相比，咪康唑（贴片、凝胶或爽剂）在治疗口腔念珠菌感染，尤其是鹅口疮具有更低的复发率[17]。氟康唑和伊曲康唑则具有更好的药代动力学和广谱抗菌活性，是治疗真菌感染的一线药物，且对艾滋病感染者具有更好的疗效[1，13]。但由于唑类药物典型的抑菌性而非杀菌性，该类药物的频繁使用会导致广泛的耐药性。妊娠前三个月口服高剂量氟康唑（＞450mg/d）甚至会增加新生儿肌肉骨骼畸形的风险[18]。

2.多烯类：多烯类药物是大环内酯的两亲性有机天然分子，其通过小分子形式插入细胞膜与麦角甾醇结合形成跨膜通道，最终导致细胞内外离子失衡、膜完整性破坏和细胞死亡[19]。近期，有研究表明多烯类药物的抗菌机制为以大的膜外聚集体形式存在，通过提取膜内麦角甾醇破坏细胞膜完整性[20]。局部用药的制霉菌素不易被胃肠道吸收，因此药物毒性弱，不良反应少，常用于治疗黏膜、皮肤、消化道感染[1，21]。两性霉素B是治疗深部危重真菌病的首选药物，仅供静脉滴注。由于两性霉素B特异性差，容易与细胞膜胆固醇结合，损伤肾组织。而新研制的脂质体包埋的两性霉素B（L-AmB）与真菌细胞膜结合后，外面的脂质体才水解，释放里面的两性霉素，可高浓度特异性杀灭真菌，降低了对其余组织的毒性损害[1，14]。

棘白菌素类药物常用于治疗侵袭性念珠菌感染，但由于受其大分子结构限制，口服生物利用率低，常需静脉注射，且成本较高，尚需研发新的棘白菌素类衍生物[13，22]。嘧啶类药物常与两性霉素B或氟康唑联合用药作为辅助治疗以减少耐药问题，但一般不用于初级治疗[1，23]。棘白菌素类与嘧啶类药物由于给药途径、药理作用等方面限制，一般不单独用于浅表口腔念珠菌感染的治疗，在此不做详述[14]。

三、生物膜的耐药机制

口腔中微生物大部分是以生物膜的形式存在。即使在没有基因突变的情况下，生物膜黏附于口腔黏膜几分钟后便可检测到耐药性，而细胞外基质包裹的成熟生物膜更能够耐受比浮游细胞高达1000倍的抗真菌浓度[24]。目前对生物膜的耐药机制尚未完全明确，我们将重点介绍这一领域的已有研究结果和最新进展。

1.药物外排泵：外排泵可增加菌体内药物外排，减少治疗药物在细胞内积累，抵御外界刺激。研究表明唑类耐药菌株中，外排泵中的ATP能量依赖型结合转运蛋白（CDR1和CDR2）和易化载体超家族蛋白（MDR1）等基因往往过度表达或突变[25，26]。Mukherjee等[27]发现与亲本株相比，敲除了外排泵基因的突变株在生物膜形成早期对药物敏感性显著提高。而随着生物膜的逐渐成熟，两种菌株对药物敏感性没有明显差异，这可能是由于生物膜生长后期其他耐药机制（麦角甾醇含量变化）的增强导致药物外排泵作用减弱的结果。CDR1、CDR2和MDR1的过度表达并没有影响生物膜对棘白菌素和多烯类药物的敏感性。Lohberger等[25]的研究证明锌族转录因子TAC1、MRR1是外排泵CDR1、CDR2、MDR1等基因的关键调控因子，突变的转录因子使外排泵基因表达上调，从而导致早期生物膜耐药性的产生，但突变为何对中晚期生物膜影响较小尚未阐述。近年来多种外排泵抑制剂被发现，为研制新的非外排蛋白底物抗真菌药物提供了新的思路[28]。

2.持留菌：念珠菌生物膜中的持留菌是在2006年首次发现的。不同于耐药菌的基因突变，持留菌是一类能够在致死剂量依然存活的同基因型、仅表型变异的亚群[29]。当抗真菌药物作用时，持留菌进入增殖缓慢的低活力休眠状态，此时细胞功能关闭，药物作用靶点失效，从而逃避药物杀伤。药物浓度代谢降低后，持留菌恢复其活力，导致感染复发[29，30]。持留菌主要在生物膜的初始黏附阶段形成，在浮游菌中并未检测到持留菌[29]。细胞的转录分析显示，合成持留菌的麦角甾醇（ERG1和ERG25）和β-1，6葡聚糖（SKN1和KRE1）所涉及的基因表达异常[31]。这些结果暗示了持留菌的耐药机制与细胞膜、细胞壁结构改变有关。目前对持留菌的形成机制并无定论，但普遍认为与营养缺乏、代谢产物堆积、氧化应激反应等多种因素有关[29]。

3.细胞外基质：细胞外基质作为保护屏障防止抗真菌药物渗透到目标靶点也被认为是生物膜耐药的关键机制之一。研究发现生物膜基质中的重要组成成分β-1，3-葡聚糖可优先与抗真菌药物特异性结合，减少了细胞壁中β-1，3-葡聚糖的破坏，从而增加白色念珠菌的耐药性[32]。近期研究了β-1，3-葡聚糖酶的抗生物膜活性，实验表明其可降解生物膜中的β-1，3-葡聚糖，使基质破坏的细胞对抗真菌药物的敏感性增加[33]。但β-1，3-葡聚糖酶并不影响浮游菌的生长与黏附，而是通过降低生物膜细胞的聚集，阻止生物膜的进一步形成发挥作用[33]。除此之外，基质中其他组分，如胞外DNA可促进不同物种间生物膜的黏附与共聚，而特定的DNA酶在不破坏细胞膜的情况下干扰生物膜的结构完整性[34，35]。