2型糖尿病大血管病变大鼠模型的研究进展

彭思涵 徐刚 谢菊 梁小利 王红艳 谢春光

糖尿病大血管病变是糖尿病主要慢性并发症之一，是糖脂代谢紊乱的综合后果，其实质是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)病变，主要表现为心、脑、下肢大血管及糖尿病足的病变。较非糖尿病患者而言，糖尿病动脉粥样硬化的特点在于受累血管更加广泛、粥样病变更加弥漫、管腔狭窄更加严重以及斑块破裂更易发生[1]。血管并发症是糖尿病患者死亡和致残的主要原因[2]，研究表明糖尿病人群中冠状动脉粥样硬化性心脏病死亡率是正常人群的2～3倍[3]，糖尿病大血管病变的防治是糖尿病治疗的重要内容。故建立理想的2 型糖尿病(T2DM)大血管病变动物模型对深入研究糖尿病大血管病变有较为深远的意义。

在常用的实验动物中，猴和猪的系统发育及饮食结构与人类相似，而且可以产生自发性AS，是理想的大血管病变实验动物，但由于其购买难度较大、饲养费用昂贵，目前难以作为普遍推广的模型使用[4-5]。家兔和大鼠是研究AS最常用的模型动物，两者均有各自的特点：家兔对高脂饮食尤为敏感，在高胆固醇饮食喂养下能快速形成以高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-C，HDL-C)为主的高胆固醇血症，但仅能形成早期脂质条纹，不能形成纤维斑块，故家兔不易产生自发性AS[5-6]；大鼠虽然具有天然抗AS性，但由于其易获得、易饲养以及生理结构、食性与人类相似，具有经济效益高、生存能力强等特点，故人们还是在不断摸索建立合适的大鼠T2DM大血管病变模型。

目前T2DM鼠类模型分为自发性T2DM模型、诱发性T2DM模型、转基因/基因敲除T2DM模型三大类，其中T2DM大血管病变建模主要应用自发性与诱发性糖尿病模型，常用GK大鼠、SD大鼠及Wistar大鼠等进行造模。本文将从自发性、诱发性T2DM大血管病变大鼠模型的构建、应用、注意事项等多方面进行阐述，归纳其研究进展，为研究人员选择合适的动物模型提供参考。

1 运用GK大鼠进行自发性T2DM大血管病变模型的建立

钟惠菊等[7]采用6月龄雄性GK大鼠作为研究对象，适应性饲养1周后，随机选取血糖值大于11.1 mmol/L的GK大鼠，同时喂饲高脂饲料(成分比例为：普通饲料87.5%、精炼猪油10.0%、胆固醇2.0%、猪胆盐0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%)。在喂饲高脂饲料的基础上加用10 mg/(kg·d)一氧化氮合成酶抑制剂-N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)灌胃。连续8周。结果显示模型组GK大鼠和正常组比较，三酰甘油(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)升高，HDL-C明显下降；光镜下模型组可见内皮细胞肿胀，其下聚集大量泡沫细胞，胶原纤维玻璃样变，平滑肌细胞排列紊乱，为AS早中期典型病变。

刘桠[8]选用5月龄雄性GK大鼠，适应性饲养1周后，将随机血糖值大于11.1 mmol/L的GK大鼠纳入实验。模型组喂饲高脂饲料(成分比例为：普通饲料88.2%、精炼猪油10.0%、胆固醇1.5%、猪胆盐0.3%)的同时将浓度为0.1 mg/(mL·d)的一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME加入大鼠饮用水中供其自由饮用。造模时间为5周。结果显示模型组TC、TG、C反应蛋白明显升高；HE染色观察模型组腹主动脉有多少不等的内膜增厚病灶，内皮下细胞浸润，内膜断裂不平整，脂质沉积较明显等改变。证明可成功复制T2DM早期大血管病变模型。

GK大鼠是1973年在日本仙台由Goto及Kakizaki等人通过选择糖耐量处于上限的Wistar大鼠近交繁殖重复数代所形成的自发性非肥胖T2DM大鼠[9]，近年来在糖尿病及相关并发症的动物实验研究过程中得到广泛应用。GK大鼠具有血糖轻度升高、胰腺β细胞团块量减少、葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力受损等特点，其严格的筛选方式和漫长的繁育时间决定了GK大鼠稳定的生物学特性、较高的存活率及类似于人类T2DM的血糖水平与胰岛素分泌的特点[9]，其稳定的高血糖和体质量减轻的特征使GK大鼠在高脂饲料喂养的造模过程中避免肥胖因素产生的干扰。研究表明，幼年期(3～8周龄) 的GK大鼠适用于糖尿病前期相关研究的动物实验；14周龄时GK大鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显下降，为正常Wistar大鼠的25%～50%；成年(尤其是16～20周龄)的GK大鼠可作为研究胰岛细胞凋亡、炎症与纤维化的动物实验对象[10]。

关于AS的形成机制，目前广泛认为细胞内皮功能受损是早期动脉硬化的标志之一，脂质代谢紊乱所致的高脂血症是引发动脉硬化的始动因素。AS早期由于内皮细胞损伤，炎症细胞和脂质在内皮下沉积，巨噬细胞吞噬脂质变为泡沫细胞，随着炎症加重斑块逐渐进展成为早期的脂质条纹；而后在AS中期，随着生长因子和炎症介质的不断增加，平滑肌细胞由中膜向内膜迁移并增生，摄取脂质成为泡沫细胞，在炎症作用下产生大量弹性蛋白和胶原纤维，早期的脂质条纹逐渐变为纤维斑块；在AS晚期，斑块增大、管腔变窄，血流动力学改变，纤维帽变薄，斑块破裂继发形成血栓[11-12]。综上，脂质紊乱可明显损伤动脉内皮细胞，引发血管内皮功能受损进而导致AS。

L-NAME是近年来报道较多的研究造模剂，通过竞争性与一氧化氮合成酶结合，从而抑制一氧化氮的合成，进而损伤血管内皮功能，诱导早期血管炎症以及加速AS的发生。成年GK大鼠高脂饲料联合L-NAME喂养5周以上的造模方法，具有造模时间稳定、成功率高、易于推广等特点，可作为糖尿病大血管病变的优良动物模型。

2 运用SD大鼠、Wistar大鼠进行诱发性T2DM大血管病变模型的建立

文隆等[13]选用8周龄成年雄性Wistar大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组和模型组。模型组予高糖高脂饲料(成分比例为：普通饲料66.5%，猪油10.0%，蔗糖20.0%，胆固醇2.3%，胆酸盐1.0%，丙硫0.2%)喂养。4周后模型组腹腔一次注射链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg，72 h 后大鼠测随机血糖≥16.7 mmol/L，判断糖尿病大鼠模型成立。模型组继续喂养高糖高脂饲料8周后检测TC、TG、LDL升高，HDL下降，光镜下内膜厚度增加，有脂斑突向管腔或斑块形成，主动脉粥样硬化病变明显。

姚贺之[14]将Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后，禁食不禁水12 h，腹腔注射2% STZ(50 mg/kg体质量)复制糖尿病模型。1周后尾静脉采血，以随机血糖≥16.9 mmol/L为糖尿病造模成功标准。糖尿病造模成功后给予维生素D3注射液(VitD3)总量60万IU/kg体质量灌胃，平均分为3 d进行，同时予以高脂饲料喂养(成分比例为：基础饲料81.3%，胆固醇3.0%，胆酸钠0.5%，丙基硫氧嘧啶0.2%，白糖5.0%，猪油10.0%)。实验周期14周。饲料中加入胆酸钠以促进胆固醇的吸收，加入丙基硫氧嘧啶以抑制甲状腺功能、减少胆固醇代谢、升高血清胆固醇含量，其中加入高糖饮食以达到诱导AS病变的目的，加入VitD3以破坏血管壁、利于脂质沉积。高脂饲料联合维生素D诱导建模的大鼠在第14周检测发现TC、TG、LDL等水平较空白组显著升高，HDL水平显著降低；主动脉HE染色光镜下可见血管内膜增厚，有凸向管腔的脂质斑块形成。表明实验T2DM大血管病变大鼠模型成功。

黄霖等[15]将1月龄SD大鼠喂饲高脂高糖饲料(成分比例为：基础饲料加入脂肪15.0%、蔗糖20.0%、鸡蛋5.0%、胆固醇1.0%、食盐0.1%)4周以诱导胰岛素抵抗，并将SD大鼠空腹12 h后于右侧腹腔注射2%STZ 30 mg/kg (未成模者在注射1周后再注射1次)，并继续喂以高糖高脂饲料直至第6周。糖尿病判定标准为：注射后第3、7、14日测定血糖，大鼠随机血糖≥16.9 mmol/L，或出现多饮、多尿、多食、懒动、消瘦等糖尿病症状且连续2次随机血糖＞11.1 mmol/L。该实验采用1月龄大鼠通过高糖高脂饮食诱发高胰岛素血症和胰岛素抵抗大鼠模型，再通过注射低剂量STZ破坏胰岛功能，并继续予以高脂高糖饲料诱发T2DM。大鼠在注射STZ后1周成模率达67.3%。在实验第6周后HDL、LDL、TG明显增高，推测长期高血糖状态刺激脂质代谢紊乱，导致血管功能和结构的改变；通过多条途径对血管内皮产生毒性作用，加速AS。光镜下可见纤维帽，胶原纤维玻璃样变、弹力纤维断裂、大量泡沫细胞聚集等动脉内膜粥样硬化典型病变。

运用SD大鼠、Wistar大鼠进行糖尿病大血管病变造模，通常是利用高热量饮食联合化学药物诱发T2DM，通过长期高血糖状态诱发脂质代谢紊乱，损伤内皮细胞以加速AS形成，建立糖尿病大血管病变模型。该方法通过高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗后，再注射低剂量STZ部分损伤胰岛β细胞，引发糖尿病大血管病变。链脲佐菌素(STZ)是氨基葡萄糖的亚硝脲衍生物，可选择性破坏胰岛β细胞，使大鼠诱发糖尿病，β细胞损伤的程度取决于STZ的剂量。采用STZ大剂量腹腔注射或STZ少量多次注射者，病理切片显示胰岛β细胞大量破坏，故认为此方法诱发的糖尿病在发病机制上更接近于1型糖尿病[16]。目前认为高糖高脂饮食联合STZ复制出的糖尿病大血管病变动物模型为较理想的模型。

3 自发性糖尿病模型与诱发性糖尿病模型对比

以GK大鼠为代表的自发性糖尿病模型，其病理特点与人类T2DM相似，且个体差异性较小，是T2DM病理生理研究最理想的动物模型。但由于其饲养、繁殖条件严格、价格昂贵等因素，目前国内尚未普及。而高糖高脂饮食联合低剂量STZ诱发性糖尿病模型则与人类肥胖引起的糖尿病发病机制相似，具有实验周期短、造模成本较低等优点，是国内常用的T2DM建模方法。但由于大鼠对诱导剂的反应不尽相同，导致个体间差异较大，故在保证成模率的前提下应把控好STZ的剂量。

GK大鼠作为国际上公认的自发性T2DM模型，由于其遗传因素所决定的自发性糖尿病特征，比目前普遍使用的高糖高脂饮食诱导胰岛素抵抗联合化学损伤胰岛β细胞的动物模型更符合人类T2DM的病理生理，其具有个体差异小，血糖较为平稳、可观测性强等优点。

4 T2DM大血管病变造模过程中注意事项

在T2DM大血管病变的造模过程中，有以下三点值得注意：首先，在实验过程中，大鼠会在摄入高糖高脂饮食2周左右因过于油腻而影响胃口，导致大鼠体质量增加减慢，可在进食量少的白天给予5 g/只的普通饲料混合喂养，同时应尽量保持饲料的干燥和香味。也有报道称用果糖代替高糖高脂食物中的白糖会增加进食量。化学制剂STZ应现配现用、分批次配用，同时可用冰袋装好保存以防失效过快。

其次，在造模实验中一般选用雄性大鼠。研究表明雄性老鼠更易出现高脂饮食所引起的血糖升高[17]。研究发现，雄性老鼠更容易受到高脂饮食介导的慢性炎症的影响，而雌性老鼠在体质量同样增长的情况下并没有出现致病性炎症[18-19]。

再者，目前对于大鼠T2DM成模的血糖标准尚未统一。大多数文献以空腹血糖值作为诊断标准，空腹血糖标准在7.0～16.7 mmol/L之间均有报道，其中以空腹血糖大于11.1 mmol/L作为标准者居多。还有部分文献以随机血糖大于16.7 mmol/L作为大鼠T2DM诊断标准。这种差异可能由于老鼠种属不同所致[20-21]。

5 小结

综上所述，动物模型的建立首先必须符合临床的各项指标要求，并且具有标准性、可重复性、稳定性及可靠性等特点。研究者通过充分了解T2DM大血管病变发病机制及造模过程中的相关影响因素，方可根据研究目的、研究方法、模型特点、实验条件、实验经费等具体情况，有针对性的选择动物种系、造模药物、药物浓度、给药方式及造模时间等，建立高成功率的T2DM大血管病变大鼠模型，使糖尿病大血管病变大鼠造模更加标准化、客观化，这对深入研究糖尿病大血管病变的发病机制及预防治疗有着深远影响。