基质血管组分对肌腱损伤修复的研究进展*

林顺 陈津 肖杰 林荆鹏 韩雪松**

（1.福建医科大学福总临床学院，福建福州 350004；2.联勤保障部队第九〇〇医院骨二科，福建福州 350001；3.联勤保障部队第九〇〇医院福建省干细胞应用工程技术研究中心，福建福州 350001）

肌腱损伤是一种临床常见的骨科疾病，发病率呈逐年上升趋势。外伤、负荷过大可导致肌腱部分撕裂或完全断裂等急性损伤，而肌腱过度使用、组织老化是造成肌腱病变和肌腱炎等慢性损伤的常见原因。目前，临床上对肌腱损伤的常规治疗方法包括休息、冰敷、非甾体抗炎药、物理治疗、手术缝合等，但往往效果不佳。严重的肌腱损伤即使通过手术和后期护理也很难恢复其原来的强度和弹性[1]，且存在康复时间长、再损伤率高等问题[2]。干细胞具有促进组织修复与再生的功能，一些研究证实，干细胞对肌腱损伤的修复具有一定效果[3,4]。基质血管组分（stromal vascular fraction,SVF）来源于自体脂肪，富含多种功能细胞和干细胞，在组织修复和再生中呈现出巨大的治疗潜能。目前，已有大量关于SVF治疗骨科疾病的临床研究，如半月板撕裂[5]、骨关节炎[6]、椎间盘退变[7]等，本文就SVF 的功能、制备方法以及其在肌腱损伤修复方面的研究进展进行综述。

1 SVF的概念

SVF是利用中性酶消化或利用机械切割等方式从脂肪组织中获取，富含脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）、前脂肪细胞、周细胞、内皮细胞、T细胞和M2型巨噬细胞等的多功能细胞群[8,9]。SVF 中富含的ADSCs可直接分化为肌腱细胞[10]，使肌腱组织的修复再生成为可能。前脂肪细胞、周细胞、血管内皮细胞和各种免疫细胞属于支持细胞，可通过旁分泌途径调节微环境并趋化参与再生和修复。SVF 因制备方式的不同，分为细胞SVF（cellular-derived SVF,cSVF）和类组织SVF（tissue-like SVF,tSVF），前者涉及酶的消化，后者主要是使用机械法来获取异质细胞群。cSVF 是不同基质细胞表型的悬浮液，而tSVF 还保留了细胞-基质和细胞-细胞之间的相互作用[11]。脂肪微血管片段(adipose microvascular fragments,Ad-MVF)是一种新型的cSVF，含有细胞外基质和血管段，比传统的cSVF 拥有更大的血管生成潜能[12]。根据国际脂肪治疗与科学联合会和国际细胞治疗学会关于SVF的声明，SVF的概念是动态变化和不断更新的，通常通过表型CD45-、CD235a-、CD31-、CD34+，以及其他的标志物CD13、CD73、CD90、CD105等来鉴定[13,14]。

2 SVF的功能

SVF具有促血管生成、抗凋亡、抗纤维化、免疫调节、抗炎和营养作用等功能。其中一些功能与ADSCs的存在相关，而另一些则与血管壁龛和SVF中所有细胞表型之间的相互作用有关。在血管生成的过程中，SVF中的血管壁龛是与血管相关的细胞表型的重要来源，包括周细胞（外膜位置）、内皮祖细胞（管腔位置）、间充质前体细胞、外膜上的脂肪基质细胞（像鞘一样包绕着血管）和内皮细胞[15]，可作为血管生成的平台。内皮祖细胞和ADSCs 是SVF 中的两个主要干细胞群。内皮祖细胞在体外形成集落，同时具有血管生成和造血的能力[16]。新生血管形成是肌腱损伤修复的前提，为肌腱修复提供必要的营养物质，新生血管退化后，肌腱完成重塑与塑形。而内皮细胞和ADSCs 之间的相互作用对于诱导ADSCs 的促血管生成是必要的[17]。

SVF 中含有M2 型极化的巨噬细胞，可表达白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）和白细胞介素-1拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist,IL-1ra），抑制促炎性因子表达和炎症细胞的激活。此外，ADSCs可抑制树突状细胞的激活，通过产生调节性T细胞来抑制随后的获得性免疫，调节性T 细胞参与维持M2 表型的巨噬细胞[18]。肌腱炎愈合期是以M2型巨噬细胞为主的抗炎、修复的过程[19]。事实上，ADSCs 自身也能够合成并释放具有免疫调节、抗炎和促进血管生成细胞因子[20,21]。同时，ADSCs 可以减少转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的表达[22]，而TGF-β 是与组织器官纤维化最为密切的因子，因此SVF 拥有抗纤维化的功能。TGF-β1 在肌腱愈合过程中可导致肌腱组织黏连[23]，而肌腱黏连将引起患者疼痛、功能受限、运动障碍。但也有研究认为SVF 可促进TGF-β 的分泌[24]，这可能与组织、器官的条件有关，也可能受宿主组织微环境的影响，SVF 发挥其治疗功效及生物学活性的机制还需进一步去研究。

3 SVF的制备方法

SVF是从脂肪组织中分离获取的，其制备方法主要可以分为酶消化法和机械法。

3.1 酶消化法

酶消化法一般利用Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白酶，通过破坏细胞外基质中的胶原纤维来消化脂肪组织，随后加入培养基终止消化，再经离心及过滤，得到的最下层沉淀即为SVF[25]。分离过程中得到的红细胞是SVF 颗粒中的主要污染物，可以通过裂解红细胞，以分离出更纯净的SVF 细胞[26]。与机械法相比，酶消化法可以从同等重量的组织中分离出更多的有核细胞，同时酶消化法获取的细胞群中所占比例最多的是基质细胞与干细胞，造血细胞只占其中的一小部分[27,28]，细胞在分离后0 h 和72 h 的存活率更高[29]。然而，酶消化法也具有一定的风险，如果在分离过程中没有充分中和蛋白酶，可能会引发过敏反应和体内不必要的组织降解。

3.2 机械法

机械法包括洗涤、摇晃、振动、离心等技术，从吸脂物中分解脂肪组织并分离出基质细胞群。因为胶原蛋白的紧密结合，脂肪组织中的细胞仅靠机械作用很难从中分离出来[30]，机械法的细胞产量也因此比酶消化法少很多。Tonnard 等[31]通过两个注射器来回推注30次来实现脂肪的乳化，获得“纳米脂肪”，但实际上没有脂肪细胞在乳化过程中存活下来，并且移植的细胞中含有丰富的CD34+ADSCs。许多研究者在此基础上做了改进，使SVF 中的ADSCs 浓度更高[32]。卢沛伶等[33]在离心管中加入玻璃珠，利用震荡产生的剪切力对脂肪组织进行破碎，与内置式超声波破碎法效果相似，对SVF 细胞的损伤较小，保障了SVF 细胞的活性。市面上已经开发出适用于临床再生的一次性自动化设备，如Lipogems、Fatstem、Mystem等，且都获取得了一定成效。与酶消化法相比，机械法制备而成的SVF拥有完整的血管周围壁龛，可释放出更多的生长因子和细胞因子，促进组织修复和血管生成[34]，加上其更经济、耗时更少、安全性更高等优势，在临床治疗上也更受青睐。

4 SVF对肌腱损伤的修复

肌腱细胞结构单一，有丝分裂频率较低，导致损伤愈合较慢。Gonçalves 等[27]的研究表明，SVF 中分离出腱调蛋白阳性的ADSCs 与未分选的细胞群相比，在培养28 d 后，肌腱基因表达上调、合成的细胞外基质富含Ⅰ型和Ⅲ型胶原，具有肌腱祖细胞的表型特征。在生物化学方法诱导下，SVF 可分化成肌腱细胞，使肌腱再生成为可能。Polly等[35]将马的肌腱细胞与同种异体的SVF 或SVF 细胞群分离培养的基质细胞进行共培养，发现胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor,IGF-1）、基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）、TGF-β3 和TGF-β1 在SVF 组与基质细胞组中的浓度都显著升高。在肌腱愈合过程中，SDF-1α 具有强大的趋化作用[36]，TGF-β1、TGF-β3 和IGF-1 则参与调节细胞增殖和分化[37]。

4.1 SVF在屈肌腱损伤修复中的应用

屈肌腱横断是手部常见的损伤之一，多由外伤性因素引起。Nixon 等[38]利用蛋白酶建立了8 只指浅肌腱炎的马模型，通过自体SVF 治疗，发现SVF 可以减轻局部的炎症反应，显著改善纤维结构与密度，同时减少肌腱组织中Ⅲ型胶原蛋白的形成。而Lu 等[39]的研究发现SVF 治疗组的Ⅲ型胶原含量高于空白对照组，可能与SVF 的注射浓度或注射时间有关，SVF中的多种细胞因子具有浓度依赖性，微环境中SVF的生物靶标可能在肌腱损伤数小时后就已经消失或发生表型转变。Behfar等[40]将SVF与安慰剂分别注入指深屈肌腱断裂的兔模型中，于术后8周处死动物后解剖发现，SVF 治疗组较对照组的纤维排列紧密且规则，Ⅰ型胶原表达明显增加。在肌腱细胞外基质中，Ⅰ型胶原约占95%，同时还有少量Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、Ⅻ型胶原，Ⅰ型胶原的高表达和纤维规则排列对于肌腱的抗拉强度和损伤的早期愈合至关重要。但也有研究者认为，生物力学测试才是是评估肌腱治疗效果的“金标准”。Behfar 等[41]在后续实验中通过力学测试观察到在第3周和第8周时，SVF治疗组的极限载荷、屈服载荷、应力和能量吸收均显著高于安慰剂对照组。Behfar 等[42]的研究发现，SVF 和骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）均可增加损伤肌腱的生物力学性能，且在第8 周时，SVF 的能量吸收、应变和刚度相较BMSCs显著增加。

4.2 SVF在肩袖损伤中的应用

由于肌腱-骨愈合能力低、愈合时间长，导致肩袖修补术后再撕裂率为11.0%～57.3%[43]。Lu 等[44]观察了36 只冈上肌肌腱断裂的兔模型，采用SVF-纤维蛋白胶（SVF-fibrin glue,SVF-FG）与FG 进行随机对照试验，得出SVF-FG 组的最大载荷、最大强度、刚度等生物力学指标均明显高于FG对照组。Lu等[44]在原有实验基础上加以改进，观察到SVF-FG 组的肌腱-骨愈合成熟度评分显著高于对照组，Ⅰ型胶原表达水平与Ⅲ型胶原表达水平始终高于对照组，Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原面积比也明显高于对照组，骨形态发生蛋白-2 表达也有所增加。肩袖撕裂患者的肌肉状态和功能较差，影响术后康复。Gumucio 等[45]通过治疗免疫缺陷大鼠的慢性冈上肌撕裂，指出接受注射人SVF 的大鼠肌肉纤维化程度比溶剂对照组降低了40%，肌肉质量得到改善。SVF 可能是直接或间接通过调节巨噬细胞来抑制胶原合成和减少成纤维细胞的增殖[46]。

4.3 SVF在跟腱病中的应用

跟腱是人体最粗大的肌腱之一，同时也是最容易受伤的肌腱之一。富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）已被证实能够有效促进断裂跟腱的再生[47]。Albano 等[48]开展了一项SVF和PRP对比治疗43例非插入性跟腱病患者的随机对照研究，在随访6个月后发现两组的VAS 评分均明显降低，且MRI、超声和能量多普勒测量的肌腱厚度均明显增加。Usuelli 等[49]前瞻性比较PRP 和SVF 注射治疗跟腱炎的疗效，接受SVF治疗的患者在治疗15 d后疼痛缓解和功能恢复方面取得显著的临床改善，而15 d和30 d随访结果也明显优于PRP 组患者，可能是由于SVF释放的抗炎和免疫调节分子比PRP 中包含的分子具有更高和更持久的活性。

综上，传统治疗方法在肌腱损伤修复中效果不理想，SVF 能促进肌腱损伤的修复，可能为肌腱损伤的治疗提供一种疗效更持久、受损组织可再生的新疗法。SVF 还具备创伤小、安全性高、易于制备和获取等优势，在肌腱损伤修复中的应用前景得到逐步体现，但是目前尚有诸多问题需要解决，如SVF 最佳的制备方法、最适的细胞浓度、最佳的使用方式、适应证和禁忌证等，以及其在临床治疗中的效果如何，需要进一步临床试验加以确定。随着医学研究的不断深入，期待SVF在肌腱损伤修复的临床治疗上发挥其优势。