自噬对糖皮质激素作用下MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响*

2021-05-25陈俊名刘又文张虹何沛霖曹国瑞毛骁童培建岳辰

中华骨与关节外科杂志 2021年2期

陈俊名刘又文张虹何沛霖曹国瑞毛骁童培建岳辰，4**

（1.福建中医药大学中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建福州 350122；2.河南省洛阳正骨医院河南省骨科医院髋部损伤科，河南洛阳 471002；3.浙江中医药大学附属第一医院骨伤科，杭州 310006；4.浙江中医药大学，杭州 310053）

激素性股骨头坏死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of femoral head,GONFH）是骨科常见疾病，超剂量应用糖皮质激素（glucocorticoids,GCs）是其病因[1,2]。针对GONFH，目前尚缺乏有效的治疗方法，明确其发病机制和早期预防一直是研究重点。目前有研究表明，GONFH的发生发展与细胞自噬密切相关[3,4]。

自噬是细胞吞噬自身受损蛋白或细胞器并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解并重新再利用的过程[5]在维持细胞稳态、抑制凋亡、促进细胞发挥正常功能方面具有重要作用[5-7]。自噬是细胞自我保护行为，但研究发现过度激活自噬可能抑制细胞生物学功能，加速细胞死亡[8,9]。一方面，过度激活的自噬是促进成骨细胞凋亡的原因之一，抑制自噬可减轻GCs引起的细胞损伤[3]；另一方面，有研究认为自噬对GCs作用下的成骨细胞起保护作用，提高自噬水平能够有效减少GCs 作用下的成骨细胞凋亡、提高成骨活性[4]。GCs作用下成骨细胞自噬与其生物活性间的关系目前尚存争议。本研究以MC3T3-E1 小鼠成骨细胞为研究对象，探讨GCs对成骨细胞自噬以及GCs作用下自噬对成骨细胞增殖能力的影响，为从细胞自噬角度阐述GONFH的发病机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

0.25%胰蛋白酶、DMEM 高糖培养基（Gibco，美国），1%青链霉素，10%胎牛血清（HyClone，美国），地塞米松（dexamethasone,DXMS）（索莱宝，中国），雷帕霉素（Selleck，美国），CCK-8 细胞增殖-毒性检测试剂盒（东仁，日本），酶标仪（Thermo，美国），PAGE 凝胶快速制备试剂盒（雅酶，中国），LC-3B 兔单克隆抗体（CST，美国）、Beclin-1 兔单克隆抗体（CST，美国）、β-Actin 兔单克隆抗体（CST，美国），FITC 标记山羊抗兔IgG、罗丹明标记山羊抗兔IgG（中杉金桥，中国），812 环氧树脂包埋套装、醋酸双氧铀、柠檬酸铅染液（中镜科仪，中国）、正置荧光显微镜（Olympus，日本），透射电镜（JEOL，日本），RIPA 裂解液（索莱宝，中国）、DAPI 染色剂（Boster，中国）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）染色剂（碧云天，中国）、Alexa Fluor 350染色剂（碧云天，中国）。

1.2 MC3T3-E1成骨细胞培养

小鼠MC3T3-E1 成骨细胞由浙江中医药大学骨伤研究所提供，培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组、处理及检测：以不同浓度（0、10-8M、10-6M、10-4M）DXMS 分别作用于MC3T3-E1 成骨细胞，CCK-8检测不同时间（12 h、24 h、48 h）的细胞增殖能力；在上述基础上，以Western Blot、细胞免疫荧光检测各组细胞培养24 h时Beclin-1和LC-3的表达水平，透射电镜检测自噬小体数目，明确不同浓度DXMS作用下成骨细胞自噬变化特点。在上述实验基础上，将细胞分为对照组、10-6M DXMS组、3 μM RAP组、3 μM RAP+10-6M DXMS 组，以上述同样的技术检测自噬的变化及细胞增殖能力的变化，并据此明确自噬对GCs作用下MC3T3-E1成骨细胞增殖能力的影响。

1.3.2 CCK-8 检测细胞增殖：MC3T3-E1 成骨细胞常规传代培养。待细胞汇合度至70%～80%时，用胰蛋白酶消化，1000 rpm 离心5 min，收集细胞，加入10 μl不同浓度的DXMS，再加入10 μl CCK-8溶液，然后将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定。

1.3.3 Western Blot 检测Beclin-1 和LC-3B 的表达：在培养皿中用PBS 洗涤细胞，加入含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，收集到EP 管中，吹打细胞后冰冻30 min，低温12000 rpm 离心15 min，收集上清液，加入缓冲液，煮沸10 min，电泳分离后转移到PVDF 膜上，用TBS/T 洗涤20 min×3 次，一抗在4℃孵育过夜，TBS/T 清洗后加入适当稀释度的二抗，室温孵育1 h后用TBS/T洗涤20 min×3次，检测蛋白。

1.3.4 细胞免疫荧光实验对Beclin-1 和LC-3B 染色：MC3T3-E1 细胞用DXMS 处理，冷甲醇固定10 min，PBS 冲洗两次。在PBS 中孵育10 min 后用PBS 洗涤5 min×3 次。与山羊血清封闭孵育30 min 后在4℃的湿箱中孵育过夜，一抗为Beclin-1和LC-3B。弃液后用PBS冲洗细胞5 min×3次，用荧光二抗室温孵育1 h，PBS冲洗细胞5 min×3次、避光，后用DAPI重新染色，在阳性荧光显微镜下观察。

1.3.5 透射电镜检测自噬小体：细胞离心10 min 去掉上清液，加入0.5%戊二醛固定液，在4℃静置10 min、离心15 min、去掉上清液，加入3%戊二醛固定液。再将样品用3%戊二醛和1%四氧化锇再固定，丙酮分步脱水。样品依次用脱水剂和环氧树脂渗透液处理，包埋切片，室温染色，透射电镜观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，不同处理组的差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MC3T3-E1成骨细胞培养结果

待细胞汇合度至70%～80%时，用胰蛋白酶消化，1000 rpm 离心5 min，收集细胞示MC3T3-E1 细胞生长48 h，融合度达80%以上（图1）。

图1 MC3T3-E1细胞呈波浪形生长并铺满瓶底（100×）

2.2 不同浓度DXMS对成骨细胞增殖能力的影响

CCK-8测定不同时间（12 h、24 h、36 h）不同浓度（0、10-8M、10-6M、10-4M）DXMS 对MC3T3-E1 成骨细胞增殖能力的影响。与对照组相比，10-8M DXMS 组对细胞增殖无明显影响（P＞0.05），10-6M DXMS 组对细胞增殖能力影响较明显（P＜0.05），10-4M DXMS 组对细胞增殖能力的影响最明显（P＜0.05）。可见GCs浓度越高，对MC3T3-E1成骨细胞增殖能力的影响越明显（图2）。

2.3 不同浓度DXMS 对MC3T3-E1 成骨细胞自噬水平的影响

将MC3T3-E1 成骨细胞分别用0、10-8M、10-6M、10-4M DXMS处理24 h，使用Western Blot、细胞免疫荧光检测各组Beclin-1、LC-3B的表达水平，使用透射电镜检测自噬小体数量。Western Blot结果示，与对照组相比，不同浓度DXMS组的Beclin-1和LC-3B Ⅱ/Ⅰ表达上升，且DXMS 浓度越高，Beclin-1 和LC-3B Ⅱ/Ⅰ的表达水平提高越显著（图3）。细胞免疫荧光染色显示，与对照组相比，不同浓度DXMS 组的Beclin-1和LC-3B 表达量增加，且DXMS 浓度越高，Beclin-1和LC-3B 表达水平提高越显著（图4）。透射电镜可见，不同浓度DXMS组均可在成骨细胞内形成自噬小体，且DXMS浓度越高，自噬小体数量越多（图5）。

2.4 提高自噬水平对DXMS 作用下成骨细胞增殖能力的影响

CCK-8 检测结果示，加入3 μM RAP 后，成骨细胞增殖能力显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05，图6）。Western Blot 结果及细胞免疫荧光染色结果示，在10-6M DXMS 中加入自噬激动剂RAP 后，成骨细胞Beclin-1 和LC-3B Ⅱ/Ⅰ蛋白水平均明显提高，自噬小体进一步增多（图7～9）；可见提高自噬水平有助于减轻GCs对成骨细胞增殖能力的抑制。

图2 CCK-8测定不同时间点不同浓度DXMS作用下的MC3T3-E1细胞增殖率

图3 Western Blot检测不同浓度DXMS组Beclin-1和LC-3B Ⅱ/Ⅰ表达水平

3 讨论

3.1 GONFH与细胞自噬

GCs作用下股骨头内成骨细胞死亡，成骨活性下降，骨修复能力不足，继而导致骨小梁力学强度降低是诱发GONFH 发生、发展，进而出现股骨头塌陷的重要因素之一[10-12]。GCs作用下成骨细胞活性受抑的原因尚不完全明确，最新观点表明其与GCs作用下的细胞自噬密切相关[13-15]。

自噬指细胞吞噬衰老、失能的结构并回收再利用的过程，为细胞生存提供能量前体物质，是真核生物面对刺激的一种自我保护行为。正常情况下自噬维持于低水平，当缺氧、激素等刺激细胞时，自噬被激活，形成自噬小体吞噬衰老、失能的细胞结构并分解为可利用的小分子物质，重新参与能量代谢[5-7]。Beclin-1 是细胞自噬的特异性基因，其表达水平能够直接反映细胞自噬的活性[5,6]。而LC-3B 是另一种常见的自噬标志物，自噬形成时胞浆型LC3I 会转变为自噬体膜型LC-3B Ⅱ，因此LC-3B Ⅱ/Ⅰ比值可评估自噬水平的高低[7,9]。细胞面对异常环境时激活自噬产生自我保护，但只有适度的自噬活性才能发挥自我保护功能。若自噬活性不足，则无法有效清除受损、失能的细胞结构，同时胞内结构循环再利用受阻，细胞自我保护不足，最终会导致细胞损伤；而若自噬水平过高，自噬性溶酶体不仅吞噬衰老、失能的细胞结构，更会无差别吞噬正常细胞结构，细胞因自我保护过当而受损[16-18]。

图4 Beclin-1及LC-3B细胞免疫荧光结果

图5 透射电镜（15000×）下可见DXMS处理细胞后胞内形成双侧膜或多层膜结构的自噬小体（箭头所示），随着DXMS浓度增高，自噬小体数量进一步增加

图6 CCK-8测定不同时间点各组MC3T3-E1细胞增殖率

图7 Western Blot检测各组Beclin-1和LC-3B Ⅱ/Ⅰ表达水平

在骨坏死研究领域，尽管目前的研究结果明确GONFH 的发生、发展与细胞自噬密切相关，但研究结果和结论存在争议。Li 等[3]的研究发现，自噬的过度激活是促进GONFH 发生、发展的原因，抑制自噬可减轻GCs 引起的细胞损伤。而Zhang 等[4]的研究表明，在生理低剂量DXMS 作用下，成骨细胞的自噬被激活而产生自我保护，此时细胞凋亡水平极低。加入自噬抑制剂后，成骨细胞凋亡水平则明显提高，Han 等[14]的研究也得到相似结果，认为GCs 作用下成骨细胞自噬水平不足，提高自噬水平能够有效减少GCs作用下的成骨细胞死亡。

3.2 自噬对GCs作用下成骨细胞的作用

本研究中，首先明确随着GCs 浓度增高，其对成骨细胞增殖能力的抑制越强，而Western Blot、细胞免疫荧光及透射电镜等多种检测手段的结果示随着DXMS 浓度的增加，Beclin-1 和LC-3B Ⅱ/Ⅰ的表达水平均明显提高，自噬小体数量明显增加，说明自噬水平随GCs 浓度的增高而增强。随之，在10-6M DXMS 培养的成骨细胞中加入自噬激活剂RAP后，Beclin-1和LC-3B的表达水平及自噬小体数量进一步提高，而成骨细胞增殖能力变强，说明提高自噬水平有助于减少GCs对成骨细胞增殖的抑制作用，促进成骨细胞增殖。本研究发现，自噬对GCs作用下成骨细胞增殖起保护作用，随着GCs浓度的增高自噬水平明显增加，但仍表现为相对不足，不足以抵抗高浓度GCs对细胞增殖的抑制作用，提高自噬水平有助于促进成骨细胞增殖。

3.3 本研究的不足之处

①由于自噬能够对包括坏死[19]、凋亡[20]、焦亡[21]在内的多种细胞死亡方式产生明显影响，因此本研究仅分析了自噬对GCs 作用下成骨细胞增殖的影响，而未深入研究具体参与调控了哪类细胞死亡方式；②GCs诱发成骨细胞自噬的具体机制极为复杂，可能涉及多条信号通路、microRNA、LncRNA 等[22,23]，而本研究未进行相关的机制探讨。这些是本研究的不足，也是后续研究的重点和方向。