猪传染性胃肠炎病毒疫苗株S 基因的克隆及其与流行株的比对分析

侯宏艳，潘孝成，尹 磊，张丹俊，赵瑞宏，胡晓苗，周学利

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽产品安全工程安徽省重点实验室， 安徽 合肥230031）

猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV） 可引起各种年龄猪病毒性肠炎，感染后引起猪呕吐、严重腹泻和脱水，仔猪1～28 d 是该病最易感日龄，每年的1—2 月是该病高发期［1-4］。 TGEV 除了与引起猪腹泻的猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）、 猪 流 行 性 腹 泻 病 毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） 等混合感染，还能与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRSV）、猪圆环病毒 （porcine circovirus，PCV）、 猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）等混合感染［5-8］，给养猪业造成巨大危害。

近年来， 我国多个地区对TGEV 进行了流行病学调查，报道的TGEV 检测率存在差异。孙秋艳等［6］对2014—2016 年山东省部分地区TGE 流行病学调查发现，TGEV 检测率为9.3%；徐丽华等［7］对2011—2017 年浙江省猪病毒性腹泻的流行病学调查发现，TGEV 的阳性率为3.05%； 杜雅楠等［8］对内蒙古地区采集的病料进行了TGEV 检测，显示阳性率为11.76%，赤峰市TGEV 阳性率为20.83%；祖立闯等［9］在2007—2016 年的39 篇流行病学监测文献中发现TGEV 整体阳性感染率在0～31.86%， 还发现外观健康猪群仍可检测出TGEV 病原或抗体，健康猪群中普遍存在TGEV 隐性感染。 因此，对猪场进行TGEV 检测很有必要。

TGEV 为RNA 病毒， 存在遗传变异的可能。在TGEV 基因组中，S 基因编码的氨基酸是中和抗体的主要靶点［4-5，10］。因此，该研究选择了国内常用的3 个厂家的猪传染性胃肠炎病毒疫苗进行TGEV RNA 提取和S 基因序列的扩增， 并与已公布流行毒株基因序列进行比对， 建立检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR 诊断方法， 初步判断猪传染性胃肠炎病毒疫苗与流行菌株S 基因的遗传性，为临床疫苗的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 疫苗

购买国内目前广泛使用的猪传染性胃肠炎的3 个厂家的冻干疫苗，分别记作疫苗A、疫苗B 和疫苗C。

1.2 主要试剂

病毒检测用RNA 提取试剂盒（离心柱型）和Fastking cDNA 第一链合成试剂盒购自TaKaRa 公司；2×Taq mix、DNA 凝胶回收试剂盒和DL 2 500 Marker 等均购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖购自美国Sigma 公司。

1.3 RNA 提取

将疫苗A、疫苗B、疫苗C 按1 头份加入1 mL DEPC 水进行溶解，-80 ℃反复冻融3 次后，取200 μL 按病毒检测用RNA 提取试剂盒说明书提供的方法提取疫苗中的TGEV RNA，-80 ℃保存。

1.4 cDNA 链合成

将“1.3”项下保存的疫苗A、疫苗B、疫苗C 的RNA 取出溶解， 按FastKing cDNA 第一链合成试剂盒说明书的方法进行反转录，获得cDNA。

1.5 RT-PCR 检测

引物参照樊雅婷等［11］报道的，参照GenBank上TGEV 毒株的S 基因cDNA 序列设计1 对引物， 上游引物序列为5′-CCACTTCGTTAACACACC-3′；下游引物序列为5′-GATAGCCCCAACTATGGTA-3′。 该引物预期扩增片段大小为2 279 bp，为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。对“1.4”项下提取的cDNA 进行PCR 扩增，反应体系为：上、下游引物各1 μL（20 μmol/L）、cDNA 模板2 μL、2×Taq mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL， 总体系25 μL。 反应条件为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃结束反应。 得到的RTPCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.6 目的基因克隆与测序

参照DNA 凝胶回收试剂盒说明书进行目的基因凝胶回收与纯化， 纯化的目的基因片段送至通用生物（安徽）有限公司测序。

1.7 序列分析

将疫苗A、 疫苗B、 疫苗C 的S 基因序列在NCBI 网站的Blast 上与近年公开发表的来自不同地区的基因序列进行遗传分析， 得到与已知序列的同源性。 再选取登录号为AF104420.1-Britain、AY587882.1 -Nanjing、DQ811786.2 -America、EU074218.2 -Harbin、FJ755618.2 -Harbin、JQ700304 -fuzhou、KC609371.1 -Shanghai、KX900411.1 -United States、M94099.1 -Spain 和MK272773.1-Fushun 的S 基因序列，与疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列一起，用MegAlign 软件进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 目的基因RT-PCR 检测结果

对疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因片段进行RT-PCR 扩增， 均得到预期大小约为2 279 bp 的DNA 片段（见图1），并将纯化后的产物送至通用生物（安徽）有限公司测序。

图1 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C的S 基因RT-PCR 扩增结果

2.2 序列分析

将疫苗A、 疫苗B、 疫苗C 的S 基因序列在NCBI 网站的Blast 上进行序列比对， 利用MegAlign 软件进行核苷酸同源性比对分析（见图2），并绘制S 基因克隆序列的系统发生树 （见图3）。结果表明，疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列两两间的同源性在96.7%以上；疫苗A 与NCBI 已知序列的同源性在94.43%～99.82%， 疫苗B 与NCBI 已知序列的同源性在95.30%～99.64%，疫苗C 与NCBI 已知序列的同源性在93.48%～98.38%。

图2 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因核苷酸同源性比对分析结果

图3 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因克隆序列的系统发生树

选取10 个来自国内外的S 基因序列，与疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列一起，用MegAlign软件进行比对分析。从系统发生树可以看出，疫苗A 和疫苗C 在一个分支上， 且与国外M94099.1-Spain 株在同一分支上， 而疫苗B 在另一个分支上，与国内JQ700304-fuzhou 株在同一分支上。

3 讨论与结论

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是一种包膜病毒，属于冠状病毒科（coronaviridae，CoV），该病毒有一个28.5 kbp 的单链阳性RNA 基因组，S 蛋白位于病毒表面， 主要形成病毒纤突。 在功能上，TGEV 的S 糖蛋白是中和抗体的主要靶点，还与宿主细胞的嗜性有关， 能够与宿主细胞受体相互作用， 让病毒侵入细胞；S 蛋白还决定TGEV 的血凝活性。 有学者认为TGEV 的S 基因为易变基因，对TGEV 的S 基因进行克隆和分析值得深入研究［4］。

该研究购买了市场上常用的TGEV 疫苗A、疫苗B 和疫苗C，提取疫苗中TGEV 的RNA，对S基因片段进行RT-PCR 扩增， 均得到了预期大小的基因片段。 将获得的S 基因序列在Blast 上进行比对后发现，疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列两两间的同源性在96.7%以上，且3 种疫苗的S 基因与NCBI 已知序列的同源性超过96%的占比在80%以上，说明目前TGEV 流行株的S 基因变异较低，市场上所用疫苗能有效防控TGEV，与孙秋艳等［6］对山东省部分地区的TGEV 检测的检出率为9.3%， 检出率相对其他常发病（PEDV、PRRS、PCV等）要低的结论相符，与樊雅婷等［11］研究分离的T04 株S 基因变异较低且相对稳定一致。

在对TGEV 的研究中， 朱蕴暖等［12］建立了TGEV 的间接免疫荧光（IFA）检测方法，王赛［13］用抗TGEV 重组N 蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体建立了一种双抗体夹心ELISA 检测方法。 在开发有效的抗TGEV 疗法中，单玲玲等［14］认为IFN-y可作为一种有效的治疗制剂。 但在实际生产中，TGEV 仍然以疫苗预防为主， 病原检测多采用RT-PCR 方法，如李嘉琛等［15］对内蒙古某猪场的粪便样品进行RT-PCR 鉴定，郭容利等［16］设计32对PCR 引物分片段扩增TGEV 江苏分离株JS2012 全基因组并进行分析。 在该研究中建立的TGEV 的S 基因RT-PCR 方法，成功获得了TGEV疫苗中的S 基因， 所以该方法可以用来检测腹泻病猪是否感染了TGEV，对监测TGEV 的S 基因变异情况和对TGEV 的防控都有生产意义。