AD患者血清核酸氧化损伤产物与抗氧化物质相关性分析

李文正， 禹松林， 尹逸丛， 于佳磊， 王丹晨， 邹雨桐， 邱 玲

（中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是常见的神经退行性疾病之一，早期干预可能是延缓AD进程的重要措施[1]。氧化应激与自由基损伤假说被认为是AD的重要发病机制[2]。有研究结果显示，在AD患者中，DNA和RNA的氧化损伤比蛋白质、脂质氧化损伤出现更早[3]。研究AD患者DNA和RNA氧化损伤与体内抗氧化损伤物质之间的关系，对AD的防治具有重要意义。8-氧化脱氧鸟苷（8-oxo-7，8-dihydro-deoxyguanosine，8-oxo-dGsn） 和8-氧化鸟苷（8-oxo-7，8-dihydroguanosin，8-oxo-Gsn）是公认的评价DNA和RNA氧化损伤的重要标志物。已有研究证实8-oxo-dGsn等核酸氧化损伤产物可作为AD早期筛查及干预的指标[4]。维生素（vitamin，Vit）A、Vit E及微量元素硒具有抗氧化功能，可能与β-淀粉样蛋白（amyloid beta protein，Aβ）清除及认知功能有关[5-6]。目前，有关DNA和RNA氧化损伤与Vit A、Vit E及微量元素硒的关系尚未见相关报道。本研究拟分析AD患者核酸氧化损伤产物与抗氧化物质之间的关系，以期为AD的预防及早期干预提供帮助。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年11月—2019年3月中国医学科学院北京协和医院明确诊断为AD的患者55例，其中男28例、女27例，年龄（74.13±1.34）岁。选取同期中国医学科学院北京协和医院体检健康者64名作为正常对照组，其中男32名、女32名，年龄（68.45±1.41）岁，肝功能、肾功能和脂代谢22项指标（钾、钠、氯、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、总胆红素、直接胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、尿素、尿酸、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、无机磷、总钙）均正常。2个组之间年龄及性别差异均无统计学意义（P>0.05）。将所有对象按年龄分为<60岁、60～69岁、70～79岁和≥80岁4个年龄段。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理 采用促凝管采集所有对象清晨空腹静脉血3 mL，室温静置60 min，2 500×g4 ℃离心10 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存，测定时室温复溶。本研究所用的血清样本均为临床检测剩余血清。

1.2.2 8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn测定 使用液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn[7]。基本步骤：将血清样本/标准品加入同位素内标溶液，与乙腈充分混匀后离心，吸取离心后的上层有机相，加入96深孔板，干燥后使用去离子水复溶，摇床震荡混匀，上机检测。检测仪器为Xevo TQ-XS液质联用分析仪（美国Waters公司），色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm；美国Waters公司），以0.1%甲酸水溶液和甲醇分别作为流动相，梯度洗脱，流速为 0.4 mL/min，柱温30 ℃。质谱采用电喷雾正离子模式，多重反应监测模式。

1.2.3 Vit A和Vit E检测 采用LC-MS/MS检测Vit A和Vit E水平[8]。基本步骤：将血清样本/标准品加入内标溶液，混匀，依次加入甲醇及ZnSO4溶液沉淀蛋白质，然后加入正己烷，震荡混匀后离心，取上清液，干燥后使用甲醇水溶液（V∶V=80∶20）复溶，上机检测。检测仪器为ACQUITY UPLC系统（美国Waters公司）串联AB SCIEX 4000 QTrap 质谱仪（美国SCIEX公司）。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Phenyl 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；美国Waters公司）。流动相A相为0.1%甲酸溶液、B相为甲醇。梯度洗脱，流速为 0.4 mL/min，柱温45 ℃。质谱采用电喷雾正离子模式，多重反应监测模式。

1.2.4 血清硒检测 采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）检测血清硒。基本步骤：取200 μL完全复溶的血清样本置于试管中，加入1 800 μL预配置的稀释液[0.1%硝酸（60%～70%）+0.01%Triton X-100），涡旋震荡混匀1 min，上机检测。检测仪器为iCAP Q电感耦合等离子体质谱仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件及Prism 8.2.1软件进行统计分析。采用Kolmogorov- Smirnov检验判断计量资料的正态性。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU秩和检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关分析评估各项指标之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD组与正常对照组各项指标检测结果比较

AD组血清硒、Vit A水平显著低于正常对照组（P<0.01），血清8-oxo-dGsn水平显著高于正常对照组（P<0.01）。血清Vit E及8-oxo-dGsn水平2个组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 AD组与正常对照组各项指标检测结果比较

2.2 AD组与正常对照组不同年龄段各项指标的比较

AD组各年龄段血清硒水平均低于正常对照组同年龄段（P<0.01）；<60岁和60～69岁2个年龄段血清Vit A水平均低于正常对照组同年龄段（P<0.01），血清8-oxo-dGsn水平则高于正常对照组同年龄段（P<0.05）。2个组70～79岁和≥80岁2个年龄段血清Vit A、8-oxo-dGsn水平差异无统计学意义（P>0.05）。正常对照组各年龄段血清Vit E、8-oxo-Gsn水平与AD组同年龄段比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 AD组与正常对照组不同年龄段之间各项指标的比较

2.3 各项指标之间的相关性

在所有人群中，血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平与年龄呈正相关（r值分别为0.443、0.782，P<0.01），血清硒水平与血清Vit A、Vit E水平呈正相关（r值分别为0.330、0.401，P<0.01），血清8-oxo-dGsn水平与血清8-oxo-Gsn水平呈正相关（r=0.644，P<0.01）。

在正常对照组中，血清硒水平与血清Vit A、Vit E水平呈正相关（r值分别为0.402、0.434，P<0.01），但血清Vit A水平与血清Vit E水平无相关性（r=0.192，P>0.05）。

在AD组中，血清8-oxo-Gsn水平与年龄呈正相关（r=0.474，P<0.01），血清硒、Vit A、Vit E水平与年龄均无相关性（r值分别为0.054、0.020、0.229，P>0.05）；血清硒水平与血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平均无相关性（r值分别为-0.105、-0.047，P>0.05），血清Vit A水平与血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平均无相关性（r值分别为-0.112、-0.098，P>0.05），血清Vit E水平与血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平均无相关性（r值分别为0.116、0.072，P>0.05）。

3 讨论

目前，AD已成为全球范围内的重大公共卫生问题。氧化应激与自由基损伤可能在AD的发生、发展中起主要作用。因此，了解患者体内氧化应激状态对AD的及时干预、早期防治具有重要意义。已有的研究往往通过讨论氧化损伤产物或抗氧化物的某一方面来进行干预前评估，缺乏对二者的综合分析。为此，本研究综合分析了AD患者核酸氧化损伤产物与抗氧化物质水平及二者间的关系，以期对AD的早期干预和预防提供帮助。

有研究结果显示，8-oxo-dGsn在组织中的累积是AD发生的早期事件，并贯穿疾病全程[4]。本研究结果显示，AD组血清8-oxo-dGsn水平显著高于正常对照组（P<0.01），提示AD患者体内有更严重的DNA分子氧化，与文献报道[9]相符。本研究正常对照组血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平与年龄呈正相关（r值分别为0.449、0.724，P<0.01），提示或可将8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn作为衰老相关生物标志物[7，9-10]；但AD组血清8-oxo-dGsn水平与年龄无相关性（r=0.113，P>0.05），可能是AD患者氧化应激状态加重，超过了自然衰老进程中产生的氧化应激水平所致[11]。本研究结果还显示，AD组与正常对照组血清8-oxo-Gsn水平差异无统计学意义（P>0.05）。

本研究结果显示，AD组血清硒水平显著低于正常对照组（P<0.01），对不同年龄研究对象进行进一步的分层分析，AD组各年龄段血清硒水平显著低于正常对照组同年龄段（P<0.01）。硒在AD病程中最重要的作用是参与构成多种酶，参与抗氧化代谢，减少Aβ斑块形成，缓解tau蛋白过度磷酸化[12]，AD患者体内较低的硒水平反映了机体抗氧化物质的相对不足[12-13]。有研究发现AD患者认知功能的降低与Vit A缺乏[14]。临界状态的Vit A轻度缺乏也已被证明是AD发生的危险因素之一[14]。本研究结果显示，AD组血清Vit A水平显著低于正常对照组（P<0.01），且总体水平偏低，接近临界低值（0.2～0.3 mg/L）[14]，在AD治疗过程补充足量的Vit A可能对延缓AD进程有一定作用。尽管Vit E在AD治疗中发挥着重要作用，但本研究AD组与正常对照组之间血清Vit E水平差异无统计学意义（P>0.05）。考虑到饮食结构调整和药物应用对Vit E水平的影响[15]，以及治疗方案在临床应用的程度，血清Vit E水平可能无法有效反映AD患者机体原有的抗氧化能力。

本研究的局限性在于AD患者例数较少，缺乏疾病进程等临床资料，且高龄患者多合并基础疾病，如慢性肾病、心血管疾病、糖尿病等，这些疾病往往也涉及氧化应激机制。后续研究将进一步扩大样本量，收集疾病进程等相关资料，以进一步明确核酸氧化物质及抗氧化物质的关系，及其在AD发生、发展中的作用。

综上所述，AD患者体内含有高水平的DNA氧化损伤产物8-oxo-dGsn和低水平的抗氧化物质硒。8-oxo-Gsn、8-oxo-dGsn与Vit A、Vit E和硒的关系及其在AD致病机制中的作用尚需进一步研究。