面膜类化妆品微生物检查方法学研究

杭 婧

（淮安市食品药品检验所，江苏 223300）

面膜是当今社会最常见的日用化妆品之一，尤其受爱美女士的喜爱。不同功能的面膜有不同的功效，如深层清洁、淡斑祛痘、补水保湿、改善暗沉肤色等。化妆品成份中含丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素、无机盐和水分，pH值约4～7，极利于微生物的生长和繁殖，导致化妆品腐败变质，严重影响化妆品的卫生质量与使用的安全性，对人们的健康造成危害［1］。面膜类化妆品一旦受到微生物污染，就会引起皮肤感染或者过敏。为了抑制面膜内微生物的生长，商家在面膜产品中添加了多种类别的防腐剂，有的是单一防腐剂，有的是联合添加不同类别的防腐剂以达到更好的抑菌效果。由于面膜类产品中防腐抑菌剂存在实际添加与标签不一致的情况［2］，防腐剂的滥用容易出现样品阳性菌检出率低甚至“全部合格”的情况。本文参考《中国药典》2020年版微生物限度检查方法进行方法验证，以消除产品抑菌物质的影响，提高阳性检出率，真实地反应样品受微生物污染的程度。

1 仪器与材料

1.1 仪器 洁净工作台（BCM-1600A，苏州安泰空气技术有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（101-3，上海跃进有限公司）；SPX-350型生化培养箱；高压蒸汽灭菌锅（MLS-3781L-PC型，松下）；生物安全柜（BSC-1304IIA2，苏州安泰空气技术有限公司）；电子天平（PL6001，梅特勒公司）。

1.2 试验样品 样品A：Dr.magic黑金备长炭控油净致面膜（批号WR022D，科丝美诗广州化妆品有限公司）；样品B：SKIN Advanced卓沿白金水耀肌光感晶润焕采面膜（批号202309010I01，华安堂生物科技集团有限公司）；样品C：御泥坊清爽平衡泥浆面膜（批号N352G11F，湖南欧标化妆品有限公司）；样品D：纽西之谜南极冰藻清爽保湿面膜（批号LC082201BB，上海利莱日化有限公司）；样品E：欧束梦幻臻颜修护面膜（批号20190902，广东巧巧生物科技有限公司）。以上样品均来自2021年国家监督抽检。

1.3 菌株 枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）［CMCC（B）63501］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基与试剂 卵磷脂-吐温80营养琼脂（批号1090181），孟加拉红（虎红）琼脂（批号1096661）、SCDLP液体培养基（批号1087061），双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基（批号1080131）、Baird-Parker琼脂基础（批号1092405）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号1081171）、伊红美蓝琼脂培养基（批号1091601），以上培养基规格均为250 g，均来源于广东环凯微生物科技有限公司；卵黄亚碲酸钾增菌液（批号6108128），广东环凯微生物科技有限公司。无菌氯化钠注射液（250 ml∶2.25 g，批号200514 2C），江苏淮安双鹤药业有限责任公司。

2 方法

2.1 菌液制备 选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的三代新鲜培养物，用无菌氯化钠注射液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

2.2 供试液制备 按照2015年版《化妆品安全技术规范》［3］进行供试液（1∶10和1∶100）制备。

2.3 微生物计数方法适用性试验

2.3.1 常规法 ①试验组：取供试液1 ml加入“2.1”项下制备的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，混匀，倾注卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃培养箱内培养48 h，霉菌和酵母菌倾注虎红培养基，置28℃培养箱内培养5 d，同时均设空白对照。②菌液组：取稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。③供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。参考《中国药典》2020年版四部，5种试验菌回收率在50%～200%，符合方法适用性试验要求。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数的50%，可采用稀释法、薄膜过滤法等方法。

2.3.2 培养基稀释法 试验组：分别取1∶10供试液0.5 ml/皿和1∶100供试液1 ml/皿加入5种试验菌液，混匀，其余操作同常规法。

2.4 控制菌方法适用性试验

2.4.1 常规法 ①耐热大肠菌群（10 ml/管）：取1∶10样品供试液10 ml，分别接种于2管10 ml双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基，其中一管不加菌作为阴性对照组，另一管加入不大于100 cfu的大肠埃希菌作为试验组。②铜绿假单胞菌（90 ml/瓶）：取1∶10样品供试液10 ml，分别接种于90 ml的SCDLP培养基中，其中一瓶不加菌作为阴性对照组，另一管加入不大于100 cfu的铜绿假单胞菌作为试验组。③金黄色葡萄球菌（90 ml/瓶）：取1∶10样品供试液10 ml，分别接种于90 ml的SCDLP培养基中，其中一瓶不加菌作为阴性对照组，另一瓶加入不大于100 cfu的金黄色葡萄球菌作为试验组。

2.4.2 稀释法 铜绿假单胞菌（200 ml/瓶）：取1∶10样品供试液10 ml，分别接种于200 ml的SCDLP培养基中，其中一瓶不加菌作为阴性对照组，另一瓶加入不大于100 cfu的铜绿假单胞菌作为试验组，置36℃培养24 h，划线于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基，置36℃培养24 h，观察结果。

3 结果与分析

3.1 微生物限度回收率 以《中国药典》2020年版中各试验菌回收率在50%～200%为参考标准，样品C采用常规法检验的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌均小于50%，采用1∶100供试液1 ml/皿稀释法时，枯草芽孢杆菌回收率达到60%，铜绿假单胞菌达到83%，采用1∶10供试液0.5 ml/皿稀释法时，白色念珠菌回收率达到77%。样品D采用常规法检验时铜绿假单胞菌小于50%，直到采用1∶100供试液1 ml/皿稀释法时，回收率达到62%。样品A、B、E采用常规法检验时各试验菌回收率均达到要求（大于50%），结果见表1。

表1 计数方法适用性试验回收率 %

3.2 控制菌检查方法适用性 Dr.magic黑金备长炭控油净致面膜（样品A）、SKIN Advanced卓沿白金水耀肌光感晶润焕采面膜（样品B）、御泥坊清爽平衡泥浆面膜（样品C）和欧束梦幻臻颜修护面膜（样品E）采用常规法进行控制菌（耐热大肠菌群10 ml/管、金黄色葡萄球菌90 ml/瓶、铜绿假单胞菌90 ml/瓶）方法学验证时，试验菌均可检出，阴性对照组均无菌生长，可见样品A、B、C和E可采用常规法进行试验。纽西之谜南极冰藻清爽保湿面膜（样品D）采用90 ml/瓶进行铜绿假单胞菌进行试验时，试验菌未生长，培养基体积增加至200 ml/瓶时，检出铜绿假单胞菌，阴性对照组均未长菌。可见样品D可采用培养基稀释法进行试验。见表2-4。

表2 耐热大肠菌群方法学研究结果

表3 金黄色葡萄球菌方法学研究结果

表4 铜绿假单胞菌方法学研究结果

4 讨论

4.1 包文君［4］对台州市1 978份化妆品进行微生物检查，合格率为98.43%。李海芳等［5］对新疆2016—2018年度进行541批化妆品微生物指标检测，总合格率为95.7%。由此可见，化妆品微生物合格率存在普遍偏高的现象，论其原因：一方面是生产厂家对产品质量把控严格，产品质量过硬。另一方面就是产品内存在抑制微生物生长的成分，使得产品基质不适合微生物生长，导致微生物生长的概率很小或者完全不生长。化妆品中防腐剂可以抑制微生物的生长繁殖，虽然化妆品培养基中吐温80和卵磷脂起到一定的中和作用，但是不能完全中和产品内所有的抑菌成分，故建议对现有化妆品微生物检验方法进行改进，增加供试品阳性对照。面膜类化妆品尤其是需要长期开口的面膜，开口使用之后应注意存放条件，以免因储存不当造成微生物的入侵，引起皮肤感染。

4.2 对于霉菌和酵母菌检测，因考虑到霉菌孢子的生长特点，建议放培养箱之后逐天观察，以免按规定温度培养之后出现霉菌成片状生长、无法计数或者造成计数减少的情况；对于测定耐热大肠菌群的双倍乳糖胆盐（含中和剂）发酵管，由于部分面膜类化妆品基质黏稠，与培养基液体不融合甚至出现分层的现象，化妆品基质沉淀覆盖住产气的小导管，进而导致观察发酵管产酸产气较为困难，因此检测耐热大肠的培养基以及检测方法有待改进。

4.3 5种面膜类化妆品采用常规法检验时，一部分试验菌回收率低于50%，如御泥坊清爽平衡泥浆面膜（样品C）和纽西之谜南极冰藻清爽保湿面膜（样品D），若参照现行化妆品安全技术规范中微生物检查法进行检验，则会出现假阴性的结果，这样很容易给市场监管起到误导的作用。在微生物方法适用性检查中，对抑菌含量低的供试品，可通过培养基稀释法减少供试品抑菌物质的浓度，从而消除其对微生物生长的影响［6］。御泥坊清爽平衡泥浆面膜（样品C）采用稀释法（1∶100供试液1 ml/皿）进行需氧菌试验，稀释法（1∶10供试液0.5 ml/皿）进行酵母菌试验，可以真实反应样品的微生物污染情况，使之更符合化妆品质量控制的要求。