生物标志物检测中药注射剂抑制血小板活化作用研究

华晓东，徐 琳，税凤春

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

中药质控研究，尤其是针对高风险的中药注射剂，由于中药成分复杂，理化检测选择的一些指标成分并不一定就是其有效成分，因此可以建立一种直接与其临床效应相关的生物活性质控方法来解决这一问题。活血化瘀类中药临床功效和作用机制明确，适宜建立这样一个简单易行的生物活性测定质量控制方法［1］，来更好地控制其临床应用的有效性和安全性。

CD62p是一种血小板活化依赖性的膜糖蛋白，是公认的血小板活化的特异性生物标志物［2-3］。通过流式细胞术检测CD62p来反映血小板活化情况，方法稳定快捷，与活血化瘀药物的临床功效相关性好，并且适合进行药物的高通量筛选。本研究通过观察几种常用的活血化瘀中药注射剂对血小板活化生物标志物（CD62p）表达的抑制作用，以确定该方法用于评价药物活血化瘀生物活性的适用性。

1 实验材料

1.1 仪器及试剂 Attune NxT流式细胞仪（ThermoFisher SCIENTIFIC）。单克隆抗体（Anti-Mouse/Rat CD62p PE/Cy7（批号B223759）、Anti-Mouse/Rat CD61 PE，批号（B216420），Biolegend；Rat IgG2a-PE/Cy7（批号4290714）、Rat IgG-PE（批号4281135），eBioscience。ADP（批号SLBP6247V，SIGMA）；氯化钠注射液（批号9B82J1，中国大冢制药有限公司）。

1.2 实验动物 SD大鼠，SPF级，体重200～300 g，雌雄兼用。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2016-0001。

1.3 供试品 舒血宁注射液（批号160118C1，神威药业集团有限公司）；喜炎平注射液（批号2016042403，江西青峰药业有限公司）；痰热清注射液（批号20150911，上海凯宝药业股份有限公司）；血必净注射液（批号1703141，天津红日药业股份有限公司）；注射用红花黄色素（批号1601215，浙江永宁药业股份有限公司）。以上样品均由天津市药品检验研究院提供，临用前分别按照各个供试品的临床使用浓度，用氯化钠注射液将其配制成所需浓度溶液备用，室温保存。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件，对药物作用前后数据进行配对资料t检验。

2 试验方法与结果

2.1 抗凝血的采集和分组 取SD大鼠8只，200～300g，雌雄各半。禁食16 h后每只动物分别眼眶取血0.5ml，置于预置有3.8%枸橼酸钠抗凝（9∶1）的EP管中。将每只动物采集的抗凝血分成3份，每份50μl，一份为空白血样，一份为基础血样，一份为加药血样。

2.2 加药血样的处理和分析 取抗凝血50μl，加入适宜浓度供试品溶液50μl，轻轻摇匀，37℃作用5min，作为加药血样。各加入100μl浓度为20 UM的ADP激活，使得ADP的终浓度为10 UM，涡旋混匀1 s，反应2 min。分别加入CD62p PE-Cy7和CD61 PE各2.0μl进行抗体标记，避光4℃孵育20 min。加4%多聚甲醛0.5 ml固定20 min。加入适量稀释液后静置2 min，溶液澄清后准备上机分析。

采用488 nm氩离子激光，在以CD61-PE-H/SSC-H为坐标的图中，圈定血小板，收集5 000个血小板。在已确定的血小板细胞群中，以CD61-PE-H/CD62-PECY7-H为坐标系划分活化的（CD61、CD62p双阳性）和未活化的血小板。以活化细胞占所有血小板细胞数的百分比来反映血小板的活化率并计算药物的抑制率。见图1。

图1 CD61标记的所有血小板细胞（A）和CD61标记的血小板细胞中CD62p阳性表达的比例（B）

2.3 基础血样的制备 取抗凝血50μl，加入氯化钠注射液50μl，同上制备基础血样。ADP激活后同法处理，记录药物作用前血小板活化率。

2.4 空白血样的制备 另取抗凝血50μl，加入氯化钠注射液50μl，轻轻摇匀，37℃作用5 min，作为空白血样。除不加ADP外同法处理后上机分析，记录空白血样的血小板活化率。空白血样血小板活化率均应小于1.5%，否则该动物血样不得用于检测和结果判定。抑制率（%）

2.5 结果 具有活血化瘀作用的3种中药注射剂以及银杏达莫注射液都可明显抑制ADP引起的血小板活化，而喜炎平注射液则无此作用。结果见表1。

表1 几种中药注射剂对血小板表面CD62p表达的抑制作用比较

3 讨论

中药成分复杂，理化检测选择的指标性成分往往并非是主要有效成分，因此检测结果与临床功效也没有密切的相关性。《中国药典》2010年版中明确引入了中药生物活性测定的指导原则，为解决中药质量控制中检测指标与临床功效的相关性问题提供了一个思路。即可以通过选择一种公认的、特异性良好的生物标记物作为检测指标来反映中药在某一方面的生物活性，这种检测方法与其临床使用的效果有更好的相关性，更适合将该方法引入质量控制中。

血小板活化依赖性膜糖蛋白CD62p因其只能在活化的血小板表面表达，因而被公认为是血小板活化的特异性生物标志物，已广泛的应用于与血小板功能相关的临床研究中［4］。中医血瘀证患者普遍存在血小板活化现象［5］，而活血化瘀类中药的抗血小板活化作用是评价其临床功效的重要指标。其作用主要的表现就是抑制血小板的释放反应，进而抑制了血小板上CD62p的表达。冠心病患者具有明显的血瘀证症状，研究显示这些患者均存在CD62p的高表达，而且其CD62p的表达程度与冠心病严重程度呈正相关［6-7］。因此患者用药后疗效的评估也可以通过检测CD62p的表达来进行监测。

本研究采用CD62p作为生物标志物，以流式法检测血小板活化水平，进而评价药物的活血化瘀活性。具有活血化瘀作用的药物可以明显抑制ADP造成的血小板活化。血必净注射液主要成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归；注射用红花黄色素的主要成分是红花黄色素；舒血宁注射液主要成分是银杏叶提取物，三者的功能主治中均具有活血化瘀作用。银杏达莫注射液是由银杏总黄酮和双密达莫组成的复方制剂，其中双密达莫具有明确的抑制血小板活化的作用，因此在本研究中被作为阳性对照品。而喜炎平注射液主要用于清热解毒。在本研究中凡是功能主治中具有活血化瘀作用的中药注射剂，以及含明确血小板活化抑制剂双嘧达莫的中药复方制剂，在采用FCM进行的生物标志物检测中均表现为阳性结果，而在无此类作用的喜炎平注射液检测中为阴性结果，表明该方法对于检测药物的血小板活化抑制作用有明确的适用性，可以用于评价中药注射剂的活血化瘀活性。