血管性痴呆模型及信号通路研究进展

王玺宁，陈真

(中国药科大学，江苏 南京 211198)

血管性痴呆(vascular dementia,VaD) 是由一系列脑血管疾病(如缺血性卒中、出血性卒中、脑缺血、脑缺氧等)引起的严重认知障碍综合征，是继阿尔茨海默病(AD)之后第二大常见的痴呆类型[1]。社会人口老龄化使VaD成为公认的公共卫生问题，引起大家广泛关注，且VaD由于其高患病率及广泛的预防和补偿性治疗潜力而成为许多研究的主题[2]。血管性痴呆常伴随着进行性认知障碍、记忆力衰退、执行功能丧失(如问题解决、思维、推理、判断)及语言问题，严重的还会出现抑郁和焦虑等精神问题[3]。VaD的发生除了与年龄相关外，还与吸烟和饮酒等不良生活习惯、高血压和代谢综合征等多种疾病相关[4]。研究表明，合理的运动、戒烟、固定的认知训练、治疗高血压及高血糖都能一定程度上预防血管性痴呆的发生[5]。临床用于VaD的治疗药物较多，有胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂(NMDA受体拮抗剂)、降压药以及一些用于阿尔茨海默病或已知的降低心血管危险因素的药物等[6-8]。

目前对于VaD的病理和机制的认知尚不完全清楚，但其主要与氧化应激失衡、神经炎症反应、内皮和微血管功能障碍、胆碱能系统障碍、兴奋性氨基酸损伤等因素有关[9-10]。但由于缺乏合适的VaD动物模型，制约了对疾病的基础认识和治疗方法的发展。本综述着重汇总VaD目前常用的动物模型及疾病发展的相关病理机制，为VaD的基础与临床研究提供理论依据。

1 血管性痴呆模型的建立

1.1 血管阻断模型

1.1.1 双侧颈总动脉闭塞模型 在VaD发病机制和治疗方法的实验研究中，最常用的模型是双侧颈总动脉闭塞模型，闭塞后动物脑血流量(cerebral blood flow，CBF)早期迅速减少，造成持续的细胞损伤和认知功能障碍，用于再现与VaD患者相同的神经病理和行为改变。2-血管阻断(2-vessel occlusion，2-VO)模型或永久性双侧颈总动脉阻塞(BCCAO)模型：实验动物以仰卧位固定在板上，沿中位线切开皮肤，分离双侧颈总动脉和迷走神经，在颈总动脉远端以4号线永久结扎[11]。现也有采取改进后的实验方法，采取间隔一周左右分次阻断双侧颈总动脉，降低动物的死亡率。

1.1.2 多血管阻断模型 类似2-VO模型，也产生了同样依赖时间恢复CBF的多血管阻断模型。三血管阻断(3-VO)模型：经颈中线切口后，在基底动脉两侧切开硬脑膜和下面的蛛网膜，将脑干膜取下，暴露并永久闭塞椎动脉交界处的近基底动脉，所有经近基底动脉闭塞后存活的动物均进行BCCAO处置[12]。四血管阻断(4-VO)模型：通过钳夹椎动脉和颈总动脉10～20 min，导致CBF短期减少，产生学习和记忆缺陷，以及海马的急性神经元死亡，皮质和丘脑的少突胶质细胞凋亡。实际应用中，4-VO模型也有先永久夹闭或电灼切断椎动脉的，但会造成急性脑缺血，故改良为左右两侧血管间隔一段时间后分次阻断。

1.1.3 双侧颈总动脉狭窄(BCAS)模型 通过颈中线切口，暴露两侧颈总动脉并脱离鞘。用丝线轻轻提起动脉，然后将其置于微线圈的环之间，微线圈通过绕颈总动脉旋转来缠绕，闭塞间隔30 min左右。微线圈的内芯直径决定了脑损伤的程度，出于死亡率和重复性的考虑，常见采用内径0.18 mm、节距0.5 mm的微线圈绕双侧颈总动脉缠绕造成狭窄[13]。除了使用硅橡胶线圈外，也有通过外科手术线、电刺激等方法制作颈总动脉狭窄模型。

1.1.4 单侧颈总动脉闭塞(UCCAO)模型 这个模型只对一侧颈总动脉用缝合线永久结扎，由于慢性脑灌注不足和白质病变，实验动物出现短期记忆障碍，但是难以检测到组织学梗死。

1.2 多发性梗死和血管栓塞模型

1.2.1 多发性微梗死模型(MMI) 主要是由微球、胆固醇晶体等诱导的多发性微梗死模型，与动脉粥样硬化栓塞非常相似。沿颈中线切口，在手术显微镜下暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，用显微外科夹暂时夹住CCA和ICA,丝线松散地系在ECA的起点，并在ECA的远端结扎。一个1 mL的注射器连接着一根PE-50管，其尖端在火焰附近加热逐渐变细，通过微型剪刀做的小切口插入ECA。将导管轻轻从ECA伸入ICA腔内，重新定位显微外科夹以仅阻断CCA。新制备的微球或胆固醇晶体缓慢地注入ICA超过1 min。轻轻地取出导管，结扎血管，取出显微外科夹，关闭颈部切口[14]。MMI诱发的模型表现出与VaD相似的认知功能障碍和病理特征，并诱发迟发性脱髓鞘、海马损伤、血脑屏障损伤和炎症。

1.2.2 大脑中动脉梗塞模型(MCAO) 将实验动物在颈部中线处进行切口，分离肌肉和结缔组织，分离双侧颈总动脉结扎，迷走神经受到保护以避免损伤，在颈总动脉上开一个小切口，将线拴置入大脑中动脉起始处[15]。MCAO模型造成局部的脑缺血，线拴的选择影响脑损伤的严重程度。

1.3 其他模型

1.3.1 高脂饮食诱导VaD模型 高脂肪饮食(HFD)和海马体的认知缺陷之间有很强的联系，但其机制和影响还没有明确的研究证明。3个月HFD喂养的大鼠在学习和记忆任务中表现较差，认知障碍程度与衰老或脑损伤的大鼠相当[16]。

1.3.2 易卒中型自发性高血压大鼠(SHRSP)模型 SHRSP大鼠在出生后逐渐升至稳定的高血压，在三月龄左右发生脑卒中，若用高盐饲料喂养可促进血压上升速度和脑卒中，广泛应用于高血压脑卒中的病理生理学改变和机制研究。SHRSP大鼠在卒中后或在血管闭塞模型下，均表现出认知功能障碍，并出现小血管壁硬化、BBB破坏和炎症反应[17]。

1.3.3 糖尿病小鼠模型 用大剂量或多剂量的链脲佐菌素(STZ)诱导T1DM小鼠，发现T1DM小鼠海马中与神经发生和突触可塑性相关的基因减少，受到糖尿病诱导的微血管改变和血脑屏障破坏导致小鼠长期认知的障碍[18]。

2 通路研究进展

2.1 MAPK级联信号通路 丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可以将胞外信号从细胞表面传递至细胞内，同时通过响应各种外界刺激，如细胞因子、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、氧化应激(ROS)、生长因子(VEGF)、激素等，调节细胞增殖、分化、炎症、凋亡的过程[19]。MAPK信号级联反应由至少3个层次顺序的激酶成分组成：MAPK激酶激酶(MAP3K)、MAPK激酶(MAP2K)和MAPK。 MAP3Ks磷酸化并激活MAP2Ks，而MAP2Ks磷酸化并激活MAPK。活化的MAPK磷酸化各种靶蛋白，包括转录因子(例如c-Jun、c-Myc和ATF2)以及凋亡相关蛋白(例如Bcl-2和Bad)[20]。MAPK家族共有5个亚族,Erk1/2、P38 MAPK、c-Jun氨基酸激酶(JNK)、Erk5，研究最多的主要是Erk、P38 MAPK和JNK[21]。而P38 MAPKα和β亚型在神经元细胞谱系中普遍表达，并可在氧化应激，局部缺血及促炎细胞因子的作用下募集,从而成为中枢神经系统(CNS)中功能最强大的亚型[22]。

MAPKs可通过调节小胶质细胞或星型胶质细胞源神经炎症及调节神经可塑性参与血管性痴呆等神经相关疾病的病理生理过程[23]。体外研究表明，在与LPS激活的小胶质细胞共培养的神经细胞中，MAPK信号被激活[24]，且Erk1/2和P38 MAPK均促进急性创伤性脊髓损伤(SCI)区域激活的小胶质细胞中iNOS mRNA及其蛋白表达[25]。激活P38 MAPK可上调NF-κB表达，促进一系列炎症因子如IL-6、IFN-β的分泌，抑制抗凋亡基因Bcl2表达，促进神经元细胞凋亡。相反，使用p38抑制剂SB239063，可防止IκBα的下游磷酸化和p65(NF-κB)转移至细胞核[26]。长时程增强(Long-term potentiation，LTP)是神经突触可塑性的生物学基础，主要依赖于NMDA谷氨酸受体的激活[27]。而P38 MAPK被认为是NMDA受体的信号传导下游，增加P38 MAPK的活性会通过增加促炎细胞因子水平抑制LTP及tau[28]蛋白磷酸化。Origlia等[28]通过探讨P38 MAPK在β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的LTP抑制的作用中得出，Aβ损坏LTP主要通过晚期糖基化产物(RAGE)介导的P38 MAPK的激活。此外，抑制P38 MAPK活性会阻断Aβ诱导的神经突触的丢失[29]。因此，MAPKs信号通路广泛参与VaD的发病机制，通过抑制该通路相关蛋白表达，可以有效抑制血管性痴呆等神经疾病的发生。

2.2 PI3K/ AKT信号通路 PI3K-AKT信号通路参与调节不同生物功能，包括营养代谢、细胞增殖、转录调节和细胞存活等，所有AKT亚型均在神经系统中高度表达，并在神经保护中起重要作用[30]。脑内各种营养因子(如胰岛素样生长因子1(IGF-1)和脑源神经营养因子(BNDF))通过与它们的同源酪氨酸受体结合，将PI3K募集至质膜附近，PI3K的催化亚基在质膜的内表面生成磷酸肌醇磷酸酯PIP2和PIP3，而PIP3作为第二信使，通过借助它的N末端pleckstrin同源(PH)域，使AKT从细胞质转移到质膜上，进而通过磷酸化激酶域激活环中的Thr308和调节域HM中的Ser473位点，使AKT被磷酸化激活[28]。PI3K-AKT信号通路被激活后，可通过调节下游靶蛋白mTOR 、GSK3β和Bad等的活性，介导神经元细胞自噬、凋亡和增殖过程。

PI3K/AKT/mTOR通路对神经元细胞的影响有两个方面：首先，激活该通路会促神经元细胞生存，但是同时会干扰神经元细胞自噬过程，从而导致异常蛋白积聚，产生毒性环境；另一方面，在mTOR水平阻断PI3K/AKT促存活信号将损害细胞生长和结构，并促进自噬的增加。在这两种情况下，都必定会增加Aβ水平，最终导致神经元细胞死亡[29]。因此，保护神经功能必须通过刺激或维持正常的PI3K/AKT/mTOR存活途径和促进自噬两种途径协调起作用。AKT介导的另一个生存机制靶点是Bad。AKT可通过磷酸化Bad的Ser136位点，诱导其与14-3-3缔合，并阻止其对抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制作用，抑制神经元细胞凋亡[30]。研究表明，牛磺酸可通过Akt/Bad途径抑制海马神经元凋亡，有望成为改善T2D大鼠学习和记忆能力的候选药物[31]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的过度刺激介导的谷氨酸诱导的兴奋性毒性，是引起神经元继发性损伤的机制。而NMDA诱导的兴奋性毒性需要PI3K/AKT 下游靶蛋白mTORC1和GSK3β的参与，从而证明了这些激酶在神经元对损伤的反应中的重要性[32]。AKT通过负性调节GSK3β，减少GSK3β在Ser9位点磷酸化，增加神经突触可塑性及神经元存活。此外，GSK3β过表达可阻碍NMDA依赖的LTP的诱导，影响VaD中学习和记忆形成[33]。

2.3 TLR4/NF-κB信号通路 神经炎症是中枢神经系统(CNS)的复杂免疫反应，参与VaD的病因和病程。细胞(如小胶质细胞和星形胶质细胞)和分子(如细胞因子，补体和模式识别受体)免疫成分是神经炎症的关键调节剂，它们的活性失调会导致不适当的免疫反应，从而导致组织损伤并影响中枢神经系统功能。TLR4是toll样受体(TLRs)家族的成员，也是脂多糖(LPS)的主要受体，在小胶质细胞中表达广泛，可通过激活下游转录因子核因子(NF)-κB，增加促炎细胞因子[如：TNF-α、白介素(IL)-1β和IL-6]，趋化因子(如细胞间黏附分子ICAM-1、血管内皮黏附分子VCAM-1)以及活性氧(ROS)和氮物质(RNS)的产生[34]。NF-κB是一个普遍表达的转录因子系统，通过与抑制剂蛋白IκB相互作用，以失活的形式保留在细胞质中[35]。

研究表明，NF-κB与大脑内的免疫和应激反应密切相关，当NF-κB抑制剂浓度在脑外伤周围组织中明显升高时，可减轻继发性脑损伤并降低炎性细胞因子的表达[34]。通过2-VO在小鼠中诱导长时间的轻度脑灌注不足，会导致白质道内反应性星形胶质细胞和小胶质细胞增生，同时伴随着星形胶质细胞中NF-κB的激活，表明白质内星形胶质细胞的促炎性变化可能参与VaD的发病机制[36]。内质网应激(ER)被认为是Aβ诱导神经毒性的介质，ER抑制剂salubrinal可通过抑制NF-κB通路，抑制Aβ诱导的神经毒性，从而起到神经保护作用[37]。因此，抑制脑内NF-κB信号通路，有望通过减少神经炎症反应，减少内质网应激，保护神经元细胞正常功能，抑制VaD的发生和发展。

2.4 JAK/STAT信号通路 JAK-STAT信号传导与局部脑缺血诱导的脑损伤密切相关，且该通路的炎症信号可以介导小胶质细胞激活[38]，因此参与了VaD发病机制。Janus酪氨酸激酶(JAK)可由多种细胞外配体，如IL-6、表皮生长因子(EGF)、TNF-ɑ、睫状神经营养因子(CNTF)与多种膜受体结合后被激活[39]。JAK被激活后可磷酸化细胞质中的STAT，磷酸化后的STAT形成同源或异源二聚体，易位至细胞核，直接与特定靶基因的启动子区域结合，从而调节与炎症相关的基因的转录[40]。JAK-STAT信号通路蛋白在多种细胞中均有表达，包括神经细胞，比如STAT3、STAT1和JAK1在发育中的成人中枢神经系统中有表达[41]。

大脑损伤会导致大量炎性因子的释放，大量研究已发现大脑中动脉闭塞(MCA)引起的缺血性损伤会导致一些炎症因子如IL-6、IL-1β、TNF-ɑ水平增加[42]。因此，局部缺血是先天性易于激活JAK/STAT途径的疾病。局灶性缺血后，STAT3在反应性小胶质细胞和巨噬细胞中高度表达，并且从缺血后4 d开始STAT1的表达增加[43]。Planas等[44]发现JAK-STAT参与神经节苷脂诱导的小胶质细胞激活过程，JAK抑制剂AG490可减少与炎症相关的基因，如诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、ICAM-1、MCP-1的转录，还能抑制神经节苷脂诱导的NO释放，说明JAK-STAT通路参与脑炎症反应的早期事件。在MCAO模型中，过表达miR-31可抑制JAK1/STAT3途径的激活，减少氧化应激诱导的神经元损伤[39]。

2.5 其他相关通路或蛋白 其他相关通路或蛋白也参与了VaD的病理生理过程。胆碱能途径是最常见的与认知相关的途径，有研究表明，2VO后4周，海马中胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和乙酰胆碱(Ach)水平升高，乙酰胆碱酯酶(AChE)降低[45]。脑源神经营养因子BDNF，其在CNS尤其是海马和皮质分布广泛，可能是针对脑缺血损伤的内源性保护反应的一部分，因为BDNF的mRNA和蛋白在短暂缺血后均被上调[46]。一些主要的炎症相关介导者，被报道在缺血性脑损伤中的炎症起始中发挥重要角色。在2VO大鼠的脑血管内皮细胞中，细胞间黏附分子(ICAM-1)和血管细胞黏附分子(VCAM-1)均有显著上调[47]，而抑制ICAM-1和VCAM-1则可改善脑缺血引起的认知功能下降[48]。基质金属蛋白酶(MMP)也会参与缺血性脑损伤的病理生理，MMP-9的上调参与脑血管损伤及脱髓鞘[49]。核转录因子Narf2，可通过调节许多抗氧化剂的表达，抑制细胞内氧化应激发生，有研究发现，在Narf2敲除小鼠中发现氧化应激增加及认知功能下降[50]。

3 小结与展望

血管性痴呆是一种年龄相关的神经退行性疾病，随着人口老龄化日益加速，脑血管疾病及其危险因子导致的血管性痴呆发病率也在上升，如何有效预防和治疗血管性痴呆疾病，已成为神经学专家重点关注的对象和领域。尽管目前在定义和理解脑血管疾病与认知障碍和痴呆之间的关系方面已取得了很大进展，但仍存在一些不确定性。本文综述了血管性痴呆有效的动物模型及相关信号通路研究，为血管性痴呆的药物研究和开发提供新的思路和理论支撑。