少精子症动物模型的构建

许 卫

（浙江大学医学院附属第四医院检验科，浙江 义乌 322000）

不孕不育症约一半由男性因素造成[1]，造成男性不育的原因有很多，少精子症是其主要原因之一[2]。根据世界卫生组织（WHO）男性不育标准化检查与诊疗手册提供的标准[3]，精子数小于20×106ml-1的被认定为少精子症。少精子症可分为轻度少精症（10×106ml-1～20×106ml-1）、中度少精症（5×106ml-1～10×106ml-1）和重度少精症（＜5×106ml-1）。少精子症的发生可能与环境因素、医源性干预、化学因素、内分泌因素等有关[4]。动物模型构建是目前生物医学常用的研究方法，对探索疾病的发生机制、治疗方法等方面具有重要的科研价值。本文对少精子症动物模型构建的方法总结如下，以期为进一步筛选出建模效果较好的构建方法提供参考。

1 化疗药物构建动物模型

目前临床上使用的化疗药物虽在某些疾病的治疗上有着重要意义，但其同时会引起机体免疫抑制、血细胞异常、细胞染色体畸变等副作用，少精子症也是其中之一。常用于少精子症建模的化疗药物介绍如下。

1.1 环磷酰胺构建动物模型 环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是一种人工合成的烷化剂，主要用于治疗恶性肿瘤、风湿性疾病[5]、系统性红斑狼疮等。环磷酰胺在体外没有活性，其代谢副产物丙烯醛是主要的毒性因子，具有强氧化性。有研究表明[6]，环磷酰胺能够损害男性生殖系统，使精子形态异常，数目减少，活力下降，导致男性的少无精子症。其具体机制尚未完全明确，可能是通过产生活性氧来诱导生殖细胞毒性，并引起精原细胞DNA 合成和精子细胞RNA 及蛋白质的合成水平下降[7]。也有研究表明[8]，环磷酰胺可通过PP2A 和β-catenin 信号通路对大鼠睾丸造成损伤。韩咪莎等[9]研究认为环磷酰胺诱导睾丸生精障碍的途径主要包括：①导致生殖细胞遗传物质损伤，诱导生精细胞凋亡；②干扰A 型精原细胞分化及自我更新增殖功能；③损伤精子发生微环境。用环磷酰胺建立少精子症模型时一般采用小鼠，常用的方法有腹腔连续大剂量注射、腹腔单次超大剂量注射、长期灌胃等，其中最好的是连续大剂量腹腔注射。许卫等[10]按60 mg/kg 给小鼠腹腔注射环磷酰胺，每天1 次，连续5 天，常规饲养观察33天，发现实验组小鼠精子相对计数降低，生精小管基底膜变薄，生精细胞数目及层次明显减少，排列紊乱。刘波等[11]持续5 d 大剂量腹腔注射环磷酰胺（80 mg/kg）后，小鼠精子浓度和活力比正常组明显下降，呈现出明显的少精子症。用环磷酰胺造小鼠少精子症模型与传统腺嘌呤、雷公藤甙等相比，具有经济、周期短、易于控制、便于获取、便于观察等优点。但随着浓度的增大，其死亡率也会增加。

1.2 白消安构建动物模型 白消安（busulfan，Bu）是一种抗肿瘤药物，又称马利兰（Myleran），属氮芥类烷化剂，是甲基磺酸酯类的代表药物。在雄性生殖生物学研究中常用于消除生殖细胞，当白消安作用于睾丸时，优先作用于精原干细胞，其次为精母细胞，导致睾丸曲细精管中生殖细胞的发生过程受到损伤，从而对睾丸发育产生影响[12]。用白消安腹腔注射法能成功诱导小鼠少无精子症模型，是研究同种生精干细胞移植的主要受体模型[13]。其不仅能清除受体睾丸内源性精原干细胞，还能破坏睾丸支持细胞之间的连接。该药作为细胞周期非特异性药物，主要作用于细胞的G1期与G0期，通过与细胞的DNA鸟嘌呤起烷化作用而破坏DNA 的结构与功能[14]。暴国等[15]使用35 mg/kg 白消安在ICR、NIH、Balb/c 三个品系雄性小均可成功建立无精子症模型，并较40 mg/kg 和45 mg/kg 白消安组造模成功动物的成活率明显提高。白消安少精子症小鼠模型在2 个生精周期（70 天）内维持基本稳定，处于无精子症或低生精能力状态。周雪原等[16]认为单次注射15～60 mg/kg 白消安会使实验大鼠不同程度死亡，连续10 天累计注射剂量15 mg/kg 白消安可破坏大鼠睾丸组织的部分精原干细胞，连续10 天累计注射总剂量20 mg/kg是较为理想的实验浓度，可消除全部精原干细胞和大部分支持细胞，30、40、60 mg/kg 可致大鼠死亡或睾丸病变充血。罗小敏等[17]认为10 mg/kg 白消安间隔24 d 二次腹腔注射是建立小鼠精子再生模型的适宜剂量，增大剂量可使支持细胞GDNF mRNA 表达不足，导致精子发生不能完全恢复。该法操作简便、效果显著，但其致畸谱较广，包括颅骨骨化不全、腭裂、脑积水和肢体的畸形。

1.3 腺嘌呤构建动物模型 腺嘌呤（adenine，A）又称维生素B4，是核酸的组成成分，可参与遗传物质的合成，促进白细胞增生，可用于肿瘤化疗时引起的白细胞减少症，也可用于急性粒细胞减少症。其可造成雄性大鼠睾丸生殖功能障碍，导致精子发生减少。葛争艳等[18]研究证明，腺嘌呤构建大鼠少精子症模型，各模型组20 天后血清睾酮明显下降，随着建模时间的延长和剂量的增加，精子密度和活力出现不同程度的降低，畸形率上升，并呈一定的时效和量效关系，肝、肾指数明显升高，生殖器官指数明显降低，符合少精子症模型要求。赵罗娜等[19]证明每日200 mg/kg腺嘌呤灌胃5 周，可直接或间接导致大鼠睾丸等性腺器官损伤及脏器系数降低，进而致使精子数目减少。吕世军[20]以500 mg/ml 浓度的腺嘌呤按1∶10 与阿拉伯胶助溶后，再以1 ml/（100g·d）的剂量连续灌胃12 天，能够降低大鼠精子的密度和活力及血清睾酮T 的水平，导致生精障碍。多数研究报道使用的腺嘌呤剂量与建模时间不一，且关于腺嘌呤建模可逆性的质疑一直存在。因此，如何保持一定浓度腺嘌呤发挥持续刺激作用，使肾脏损害程度达到慢性肾功能衰竭的标准并进行性发展，同时保持较低的死亡率，是腺嘌呤模型建模成功与否的关键。

2 普通药物构建动物模型

2.1 醋酸棉酚构建动物模型 醋酸棉酚是一种男性避孕药，服用低剂量醋酸棉酚能阻断组蛋白-精核蛋白取代反应及影响精核蛋白含量，从而导致不育。Santana AT 等[21]研究证实醋酸棉酚可致大鼠附睾尾精子计数及后代数量明显减少。黄赛金等[22]对大鼠灌胃50 mg/kg 醋酸棉酚，3 天/次，连续5 次，即可制备少弱精症大鼠模型。一定剂量的醋酸棉酚经口服给药能诱导形成不同程度少精子动物模型，少精子程度与服药剂量和时间长短有关。

2.2 苯甲酸雌二醇构建动物模型 苯甲酸雌二醇是一种雌二醇衍生物，属于人工合成雌激素，皮下注射苯甲酸雌二醇可导致精子、精细胞及部分精母细胞脱落，停药后可恢复生精功能。张瑞[23]对雄性昆明小鼠分别注射含5 mg/kg、10 mg/kg 苯甲酸雌二醇的玉米油150 μl，隔天1 次，持续4 周，发现实验组精子悬液显微镜下未见精子，生精上皮细胞排列稀释，生精小管管腔内无精子。黄勋彬等[24]对小鼠注射4 mg/kg苯甲酸雌二醇，持续15 天，注射后4 周，造成生精功能的损害；但注射后12 周，曲细精管内可见精母细胞增多，20 周时部分曲细精管内可以找到精子细胞和精子，这表明小鼠睾丸生精功能部分恢复。相比化疗方法，苯甲酸雌二醇构建少精子动物模型死亡率低，但随着时间延长，小鼠生精小管中发现精子与精子细胞存在，缺乏良好的稳定性。

3 物理方法构建动物模型

3.1 热效应构建动物模型 热效应是最经典的少精子症建模方式之一，高温造少精子症模型的机制是阻断精细胞囊或伸长的精细胞囊的发育，使其退化为异常的生精囊或精子束。Kheradmand A 等[25]用43 ℃水浴局部温浴大鼠阴囊15 min 成功构建少精子症大鼠模型。Yi XL 等[26]将猴子阴囊浸没于43 ℃温水每天30 min，连续两天，睾丸局部热处理使精子数量减少、活性降低，成功构建少精子症猴子模型。高温造成的少精子症大约能在末次高温处理后维持50 天左右。但热效应仅对部分生精细胞有影响，对成熟精子与间质细胞无影响。

3.2 电离辐射构建动物模型 电离辐射对睾丸组织的影响很大，电离辐射能够轻易地损害生精上皮，导致细胞凋亡，使精子数目显著减少。研究发现[27]应用剂量为1400、1600 cGyX 射线局部照射8～10 周龄BALB/C 雄鼠睾丸，能够成功构建少精症动物模型；而当剂量为2000 cGy 时，雄鼠发生死亡。其作用机理为诱发染色体畸变，畸变率与照射剂量呈正相关。由于可能造成睾丸生精功能的永久性损伤，所以在药物筛选或药物效果评价时不宜采用此种建模方式。

4 基因敲除构建动物模型

基因敲除技术是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，整合入受体细胞的基因组中，从而达到基因敲除的目的。利用基因工程技术，敲除生精过程相关基因，如敲除小鼠TPPP2基因可导致精子数量和活力显著降低，成功构建少精子症模型[28]。但基因敲除方法存在较多弊端，构建难度也较大，且价格昂贵，限制了其应用范围。

5 总结

目前少精子症动物模型构建的方法多样化，每种模型的制备方法和机理有所不同，且存在着诸多局限性，如化疗药物法在对生精功能损伤的同时，对机体其他系统的功能也会造成损伤，因此很难排除由此造成的动物代谢功能损伤对实验结果的影响。所以我们需要根据我们研究目的选择不同类型的少精症动物模型构建方法，并且在此基础上不断优化，构建出一种更有效的稳定可靠的少精症动物模型，以达到更好的建模效果，为进一步研究少精子症的发生发展和治疗建立良好的实验基础。