非结核分枝杆菌病分子诊断技术概述

廖鑫磊 王桂荣

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)指除结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。截止2021年1月，分枝杆菌属已有240个种，24个亚种(http://www.bacterio.net/mycobacterium.html)。NTM广泛存在于水、土壤、灰尘等自然环境中，属于条件致病菌[1]。NTM病是指人体感染了NTM，并引起相关组织、脏器的病变[2]。近年来，全球NTM病呈快速增多趋势，已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[3]。NTM病与结核病在临床表现和影像学表现上都非常相似， NTM病主要依靠实验室病原学检测进行诊断。随着NTM病的增多，人们对其危害性越来越重视，早期诊断及早期治疗可降低NTM对人体的损害。为提高NTM病的诊断水平，除了需增强医务工作者对NTM病的认识，提高对NTM的检测、鉴定以及耐药诊断能力，还需增加对NTM实验室检测方法的认识，提高NTM病的病原学阳性率。对硝基苯甲酸选择性培养基法和MPB64抗原检测法仅可初步鉴别MTBC与NTM；质谱技术可鉴别至菌种水平，但不可直接用于临床标本，只可用于培养阳性菌株，不利于临床及时诊断。随着分子生物学的发展，分子诊断技术在分枝杆菌菌种鉴定中发挥着越来越重要的作用，笔者对用于NTM检测及鉴定的分子技术进行概述。

一、NTM检测技术

因NTM与结核分枝杆菌的药物敏感性不同，治疗方案存在较大差异，因此治疗前需准确地检测鉴别患者是结核病还是NTM病。现有一些分子技术可从标本中直接检测NTM或同时鉴别MTBC与NTM。Scoleri等[4]研发了一种以hsp65为靶基因的TaqMan定量PCR技术，可以直接从呼吸道样本中检测NTM。韩国3种可鉴别MTBC与NTM的试剂盒：(1)AdvanSureTMTB/NTM实时荧光PCR试剂盒，以MTBC和NTM的IS6110和转录间区序列(internal transcribed spacer，ITS)为靶基因；(2)GENEDIA®MTB/NTM实时荧光PCR试剂盒，以MTBC的IS6110以及NTM的ITS和rpoB为靶基因；(3)Real-Q MTB & NTM试剂盒，以MTBC和NTM的IS6110和ITS为靶基因[5]。检测标准菌株时，AdvanSure、Genedia、Real-Q的准确度分别为100.0%、98.8%和98.8%，检测临床菌株时3种试剂盒的敏感度均大于95%[5]。AdvanSure检测呼吸道样本时的敏感度和特异度分别为97.9%和100.0%，而非呼吸道样本占总样本30.5%时AdvanSure的敏感度和特异度分别降为91%和87%[6-7]。这是由于非呼吸道样本中含有PCR抑制物可降低实时荧光PCR技术的敏感度。NTM检测的特异度受与NTM相近的其他非分枝杆菌属细菌的影响，比如Rhodococcus，Tsukamurella，Segniliparus和Gordonia属的一些成员与分枝杆菌属在系统发育上非常相近，都属于Corynebacterineae亚纲，若样本中存在这些细菌可能会出现假阳性结果[5]。由于NTM广泛存在于环境中，特别是水中，因此样本采集时还要注意避免污染[8]。

二、NTM菌种鉴定分子技术

1. 直接探针杂交法:直接探针杂交法不需要扩增步骤，因此可以实现快速诊断。AccuProbe鉴定系统(AccuProbe；Hologic公司，美国)依靠与16SrRNA互补的寡核苷酸探针，可鉴别MTBC、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌[9]，AccuProbe的最大缺点是不能鉴定临床上非常重要的脓肿分枝杆菌。

2. 线性探针技术:线性探针技术(1ine probe assay，LPA)的原理是通过应用生物素标记的特异引物进行靶核酸(DNA)的扩增，将扩增产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶联免疫显色法显示结果[10]。比较有代表性的LPA试剂盒有INNO-LiPA Mycobacteria v2(INNOLiPA；Fujirebio Europe，比利时)；GenoType Mycobacteria CM，GenoType Mycobacteria AS和GenoType NTM-DR (Hain生命科学，德国)；Speed-oligo Mycobacteria(Vircell，西班牙)；AdvanSure Mycobacteria GenoBlot Assay(LG Chem Inc.，韩国)和 REBA Myco-ID (YD诊断学，韩国)。INNO-LiPA Mycobacteria v2以16S-23SrRNA间区为靶基因，可鉴别16种分枝杆菌[11]；GenoType Mycobacteria CM和GenoType Mycobacteria AS均以23SrRNA为靶基因，分别可鉴别14种和16种分枝杆菌[12-13]；Speed-oligo Mycobacteria以16SrRNA和16S-23SrRNA间区为靶基因，可鉴别14种分枝杆菌[14]；AdvanSure Mycobacteria GenoBlot assay以16S-23SrRNA间区为靶基因，可鉴别21种分枝杆菌[10]；REBA Myco-ID以rpoB为靶基因，可鉴别17种分枝杆菌，并可将马赛分枝杆菌与脓肿分枝杆菌区分开[15]。GenoType NTM-DR不仅可将临床常见的NTM鉴定至种水平，包括脓肿分枝杆菌复合群(脓肿分枝杆菌、马赛分枝杆菌和bolletii分枝杆菌)、龟分枝杆菌和鸟胞内分枝杆菌复合群(鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和奇美拉分枝杆菌)，同时还可以通过检测erm(41) 和rrl基因的突变情况确定NTM对大环内酯类药物的耐药性，以及通过检测rrs基因的突变情况确定NTM对氨基糖苷类药物的耐药性[16-17]。

3.基因芯片法:基因芯片又称DNA微阵列，基本原理是通过微阵列技术将多种DNA探针有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，然后与标记的样品杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术具有快速、准确、高通量、自动化程度高等优点。国内已有用于分枝杆菌菌种鉴定的基因芯片产品上市，如晶芯®分枝杆菌菌种鉴定芯片试剂盒(北京博奥生物有限公司)。该试剂盒以16SrRNA为靶基因，可鉴别17种分枝杆菌。检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为99.8%和99.7%，检测NTM的敏感度和特异度分别为98.8%和100.0%[18-19]。

4. 反向斑点杂交法:反向斑点杂交技术(reverse blot hybridization assay，REBA)工作原理为先将已编号的寡核苷酸探针点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与生物素等标记的PCR扩增产物进行杂交，通过膜条特定位置显色与否判断探针是否与该DNA片段杂交。具有敏感度高、特异度强、稳定性好的特点。国内试剂盒有分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒[亚能生物技术(深圳)有限公司]，以16S rRNA为靶基因，可鉴定临床上22种常见的致病性分枝杆菌，检测NTM的敏感度和特异度分别为87.61%和83.33%[20-21]。

5. 特异基因测序法:与传统方法相比，特异基因测序法进行菌种鉴定既快速又准确。特异基因测序法目前已经成为菌种鉴定的“金标准”。许多基因已用于分枝杆菌菌种鉴定，如16SrRNA、hsp65、rpoB、ITS、gyrB、danA、recA和secA等[22]。

获得DNA序列后，进行序列比对分析时需要使用数据库[22]。有一些公用数据库及比对工具可用，如NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify)、Ribosomal Database Project(RDP，http://rdp.cme.msu.edu)和leBIBI(https://umr5558-bibiserv.univlyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi)[23]。

16SrRNA是细菌分类和鉴定中最常用的基因，全长1550 bp左右，是30S小核糖体亚单位的重要组成部分[22]。可以使用16SrRNA全长序列，也可以使用长度为440 bp左右的5′端碱基序列差异相对集中的区域进行菌种鉴定。16SrRNA全长序列的鉴别能力优于5′端高可变区序列，但是应用5′端高可变区序列作为目标基因仅需要一个测序反应即可完成，且其鉴别能力与全长序列比较接近，因此5′端高可变区序列应用更为广泛。由于序列高度保守性，16SrRNA对一些具有临床意义的NTM分辨力较差，仅能鉴定至复合群水平而不能鉴定到具体菌种，如鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌复合群、偶发分枝杆菌复合群等[24]。hsp65比16SrRNA基因变异性大，因此鉴定能力高于16SrRNA序列，可区分16SrRNA序列无法区分的部分种类分枝杆菌，特别是快生长NTM[25]。此外，rpoB和ITS基因也常用于NTM菌种鉴定而且分辨能力较高[25-27]。特异基因测序多为实验室自建的方法，也有商业试剂盒。MicroSEQ ID系统(ThermoFisher Scientific，美国)可对16SrRNA的5′端500 bp和全长1500 bp进行快速简便的扩增和测序[28]。序列可与MicroSEQ ID图书馆的数据进行比对获得菌种匹配结果。

有些菌种存在一定的种内变异，如鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌[11,22]。还有一些NTM菌种具有完全一致的单基因序列，单基因测序并不能将这些NTM区别开，因此，需进行多基因联合比对才能鉴定至种水平[29]。

公共数据中DNA序列多样化，但对于上传的序列缺乏监管，可能存在一些不准确或错误的基因序列信息。当使用公共数据库时应仔细选取参考序列进行比对[22]。虽然也有一些商业化数据库可用，如MicroSEQ或RipSeq Single/Mixed系统(Pathogenomix，美国)，Integrated Database Network System (IDNS；SmartGene Inc.，瑞士)和GenSeizer(GenSeizer，上海，中国)[30-32]。这些数据库都还在持续更新中。

6. 全基因组测序法:在菌种鉴定和分型方面，全基因组测序法可提供最深入的信息[33]。全基因组测序具有较高的敏感度及强大的鉴别能力，在无法获得可能感染病原体线索的情况下，临床应用越来越多。目前全基因组测序的价格依然较高且全基因组测序应用的是数据处理过程。测序会产生大量数据，需要高效的计算机分析系统、较高的数据存储能力、高速的网络系统[34]，尚不适合大规模应用。全基因组测序还主要是用于流行病学研究，而非菌种鉴定。全基因组测序技术要更好的应用于临床上菌种鉴定，其操作步骤、生物信息学分析以及质量控制方面都需要进一步标准化[35]，需要结合临床医学与微生物学知识做出正确的结果判读。

随着技术进步，分子诊断技术在NTM检测、菌种鉴定方面有着独特的优势和巨大的应用前景，但应用于临床实践中，还需要结合实际情况选择合适的技术，以及提升NTM检测和菌种鉴定技术能力。