干细胞促进肌腱损伤修复研究进展

杨志金，唐康来

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院康复医学科,昆明 650032； 2.陆军军医大学第一附属医院骨科运动医学中心,重庆 400038)

肌腱是人体运动系统的重要组成部分，为致密的纤维结缔组织，其将骨骼与肌肉连接起来，辅助肌肉运动并维持骨骼的稳定性，是传递力量以实现运动所不可或缺的结构[1- 2]。肌腱损伤在体育运动及日常生活中均十分常见，全球每年大约有超过3 000万例的肌腱损伤患者，并导致超过1 560亿美元的医疗支出[3-4]。

肌腱的血液供应较差，导致其再生修复能力差，损伤后不仅其结构的完整性很难恢复，其生物力学强度也明显降低[5-6]。肌腱损伤部位经常会形成瘢痕，其会损害组织的生物力学性能和整体活动能力[7]。肌腱损伤后明显影响患者的运动功能，且肌腱损伤往往愈合不理想，影响患者的生活质量[8]。肌腱损伤后无论是非手术治疗或手术治疗均不能完全恢复肌腱的天然成分、组织结构及机械性能。目前尚无理想的治疗方法，临床迫切需要确实可行的治疗方案[9-10]。

1 肌腱的结构及功能

肌腱含有丰富的胶原纤维，是有一定弹性的致密结缔组织。胶原纤维沿着肌腱长轴平行排列，呈轻微波浪状，粗细基本一致。肌腱的组成及结构使其更适于担任连接肌肉和骨骼的角色。肌腱的主要成分是水，占肌腱重量的55%～70%。胶原是其主要的固体成分，占肌腱组织干重的65%～80%。胶原蛋白是一种刚性结构蛋白，为组织提供抗张强度，其中以Ⅰ型胶原为主，约占净重的90%，Ⅲ型胶原含量较少[11-13]。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及其组成成分对肌腱的发育和健康维持至关重要，肌腱ECM的主要成分是Ⅰ型胶原。

肌腱细胞和肌腱干细胞是肌腱组织内的主要细胞类型，占肌腱细胞总数的90%～95%。肌腱细胞是终末分化细胞，呈纺锤形，细胞核细长，细胞质薄。肌腱干细胞位于细胞外基质包绕的平行排列胶原纤维之间，可向肌腱细胞分化。

2 肌腱损伤的愈合过程

肌腱损伤愈合包括内源性因素及外源性因素，其确切机制目前尚不完全清楚[14]。现有研究认为损伤肌腱的修复可以分为3个阶段，这些阶段可以互相重叠，其持续时间取决于肌腱损伤的位置和严重程度[15-16]。

2.1炎症反应期 受损部位首先会出现血肿，中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等迁移至损伤部位，并释放炎性因子，血管生成因子启动血管生成，同时成纤维细胞开始合成Ⅲ型胶原。

2.2细胞增殖期 损伤几天后，在细胞增殖期开始合成大量的ECM成分，包括无序排列的蛋白聚糖和胶原蛋白(大部分是Ⅲ型胶原)。此阶段的另一个特征是：细胞大量增加并吸收大量水分。

2.3重塑与成熟期 Ⅲ型胶原纤维逐渐被Ⅰ型胶原纤维替代，合成的胶原纤维开始沿着肌腱长轴方向进行排列，从而恢复肌腱的刚度及抗拉强度。大约10周后，成熟阶段开始，其特征是胶原纤维交联的增加及更成熟的肌腱组织形成。

3 干细胞促进肌腱损伤修复研究现状

干细胞可以促进损伤组织修复，在合适的条件下具有多向分化潜能。干细胞不仅在个体正常发育过程中具有重要的作用，在组织损伤的病理条件下也具有重要作用。干细胞无论是在肌腱急性损伤或慢性损伤的治疗上，均具有巨大的潜能和应用前景[10]。肌腱组织工程的常用种子细胞主要有间充质干细胞、脂肪干细胞、肌腱干细胞及成纤维细胞等[17]。

3.1肌腱干细胞(tendon stem cells，TSCs) 在很长一段时间，肌腱细胞被认为是肌腱中唯一的细胞类型。直至2007年，有学者首次从人及小鼠的肌腱中分离获得TSCs[18]，并相继在多种动物的肌腱及韧带中分离获得TSCs[19-21]。TSCs表现出成人间充质干细胞相同的典型特征，如典型的表面抗原、自我更新、克隆形成和三系分化能力(成脂肪、成骨和成软骨)。Zhang和Wang[22]研究发现TSCs能够在体外分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞，在裸鼠皮下移植后也能形成肌腱样、软骨样和骨样组织。与其他的MSCs相比，TSCs表达肌腱相关基因如scleraxis(Scx)、tenomodulin(Tnmd)等[15]。由于这些独特的性质，TSCs在肌腱损伤修复、再生过程中起关键作用[10,23]。

TSCs来源于肌腱，是治疗肌腱损伤最适宜的种子细胞。Zhang等[24]研究证实，在体外实验中，脱细胞肌腱组织支架能促进TSCs增殖，并有利于其保持干细胞的干性。在体内实验中，脱细胞肌腱组织支架联合TSCs能在裸鼠体内形成肌腱样组织。Shen等[25]将兔来源TSCs在蚕丝胶原海绵支架上培养后，移植至兔肩袖损伤模型，12周后同种异体TSCs治疗组与对照组相比具有更好的组织结构和生物力学性能。Chen等[26]使用TSCs联合富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)治疗大鼠跟腱损伤，研究结果证实：TSCs和PRP对肌腱损伤有协同治疗作用，可显著促进肌腱损伤愈合。Ni等[27]用TSCs治疗大鼠髌腱缺损动物模型，结果证实治疗4周时TSCs治疗组生物力学性能明显优于对照组，TSCs能促进损伤肌腱的早期愈合。

3.2间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs) MSCs

是具有自我更新能力及多向分化潜能的多能干细胞，现已从包括骨髓、滑膜、肝脏、肌肉、脑、脂肪、胎盘和脐带等多种组织中分离得到MSCs[28]。MSCs最早于成年骨髓中发现，称之为骨髓间充质干细胞(BMSCs)[29]。BMSCs很容易分离，且自我更新和多向分化能力强，也是肌腱损伤再生领域的理想细胞来源。在治疗运动系统损伤疾病时，BMSCs由于良好的生物学特征，是使用最广泛的干细胞类型。

Kim等[30]在肩袖损伤患者修复期注射以纤维蛋白胶为载体包裹的脂肪源性MSCs，用临床及影像检查指标评价治疗效果，结果显示脂肪源性MSCs局部注射可显著降低肩袖损伤再次发生率。Chong等[31]采用兔跟腱中部完全横断损伤动物模型，研究外源性BMSCs治疗对肌腱早期愈合过程中组织结构和机械性能的影响。治疗组在纤维蛋白支架中加入BMSCs，而对照组仅使用纤维蛋白支架，在损伤后3周，治疗组细胞排列及机械性能方面均优于对照组，骨髓MSCs在肌腱早期愈合中表现出积极的作用。然而，这项研究主要局限是实验组和对照组长期效应上无显著差异。

现有研究表明MSCs在促进肌腱损伤修复方面有积极作用，其可能的作用机制包括：首先，MSCs可以调节免疫应答，并通过细胞-细胞间的直接接触，释放可溶性免疫抑制剂而发挥其免疫调节功能； 其次，MSCs可以分泌促进相邻细胞增殖的生长因子、趋化因子及预防细胞凋亡； 最后，MSCs具有多向分能力，包括：骨、软骨、肌腱、脂肪及肌肉等[32-34]。

3.3脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) ADSCs具有易于获取、来源广泛、体外扩增容易、免疫原性低、不存在伦理问题等许多优点。目前，ADSCs已在人、鸡等多种物种中成功分离[35-36]。

Uysal等[14]利用ADSCs治疗兔的跟腱损伤，组织学及免疫组化染色结果证实ADSCs可促进肌腱损伤愈合。Lee等[33]将人来源ADSCs移植至大鼠跟腱损伤动物模型，分别在损伤后2周及4周进行免疫组化、生物力学测试等检测，结果显示人来源ADSCs能促进大鼠肌腱损伤愈合，并显著提高其生物力学性能。Oh等[37]将ADSCs注射至兔的慢性肩袖撕裂部位，进行生物力学及组织学分析，结果显示ADSCs局部注射可促进肩袖损伤的愈合，并改善了肩袖组织的脂肪浸润情况。Lee等[38]用异体ADSCs治疗人的慢性肌腱病，随访52周，结果证实无明显不良反应，可显著减轻关节疼痛、改善关节活动范围及损伤肌腱的组织结构。ADSCs是一种治疗肌腱病的安全、有效的方法，是一种治疗肌腱损伤极具潜力的细胞类型，其促进肌腱损伤愈合的机制，包括刺激肌腱自身细胞增殖、合成ECM，募集肌腱自身细胞至损伤部位，从而促进肌腱损伤愈合。

3.4皮肤来源干细胞(skin-derived stem cells,SDSCs) 皮肤是一种独特的器官，是哺乳动物中能持续自我更新的少数器官之一，甚至到成年时期。皮肤含有多种干细胞用于维持皮肤的自我平衡及在皮肤损伤或疾病时促进损伤皮肤的修复。皮肤成纤维细胞在形态、功能上与肌腱细胞十分相似，且来源广泛、相对容易获取。皮肤成纤维细胞和干细胞表达相同的细胞免疫表型，并且也具有分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的多向分化能力[39]。

Liu等[40]通过动物实验证实：皮肤成纤维细胞可作为肌腱组织工程的种子细胞，以促进肌腱损伤的愈合。Obaid等[41]在一项随机双盲临床对照试验中，使用皮肤成纤维细胞治疗慢性跟腱损伤，研究结果证实皮肤成纤维细胞治疗慢性跟腱损伤安全、有效，随访6个月时疼痛评分明显优于对照组。Clarke等[42]在一项临床试验中，使用超声引导下注射自体皮肤来源的皮肤成纤维细胞治疗髌腱损伤，治疗后6周及3、6个月的随访结果证实：皮肤成纤维细胞短期治疗髌腱损伤安全、有效，和对照组相比疼痛及功能改善均十分显著。

4 小结

由于肌腱通常受到机械损伤或退行性损伤的影响，肌腱损伤后肌腱细胞的更新和功能、结构完整性的重建极其重要。干细胞治疗肌腱损伤是一项极有前景的治疗方法，能有效促进损伤肌腱修复或再生，关键在于选择合适的细胞类型。

目前尚无治疗肌腱损伤的理想干细胞，不同的干细胞有其各自的优缺点，但不使用老年或病变组织来源干细胞是明确的。

在肌腱损伤愈合的不同阶段，生长因子对干细胞的分化均具有重要调控作用。在肌腱损伤愈合过程中，转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、肝细胞生长因子(HGF)等细胞因子均具有调控其分化方向的作用。同时支架材料的研究和利用也是肌腱组织工程的关键环节，其可为干细胞生长提供稳定的外部环境。理想的肌腱组织工程支架应具有良好的生物活性、生物相容性及安全性、适宜的机械性能及力学强度、易加工及处理、合适的孔隙率及三维立体结构等。干细胞促进肌腱损伤修复过程中，使用生物支架作为载体，使用生长因子来诱导干细胞成肌腱分化，及干细胞个性化植入后增强等综合治疗方案，或许能为肌腱损伤的治疗提供完美解决方案。

在过去20年中，有关于肌腱损伤的干细胞及组织工程研究取得了许多令人鼓舞的结果。干细胞促进肌腱损伤修复在大量的动物研究中，取得了很好的治疗效果。近年来，研究人员更加关注干细胞治疗在人体肌腱损伤中的应用。在此期间也开展了许多临床前研究，但目前的研究成果仍不够完善，仍需进一步的临床研究来证实干细胞治疗的安全性及有效性。目前，只有MSCs治疗跟腱炎等少数临床试验在进行中，将来在肌腱再生医学和组织工程领域，仍需更多临床实验来验证干细胞促进肌腱损伤修复的临床疗效。干细胞促进肌腱损伤修复的机制目前尚不完全清楚，还必须进一步深入研究，使干细胞治疗肌腱损伤成为切实可行的治疗方法。干细胞无论是治疗肌腱急性损伤，还是缓解退行性肌腱病的症状，均是希望与挑战并存。