农作物种子检测中SSR与SNP分子标记方法的比较分析

李巧英

（山西省农业种子总站，太原 030006）

随着分子生物学理论和分子标记技术的发展，分子标记逐渐应用在农作物种子检测中，实现了在基因水平上分析农作物品种信息。品种间的差异通过多个位点DNA 序列长度不同或碱基组成不同表现出来，利用不同检测平台展示指纹信息，便于分析各品种不同位点的基因型，进行比对。分子标记法快速检测，避免了应用传统检测方法受自然环境条件和人员主观因素等影响的困惑。

分子标记是一种以DNA 序列变异为基础的标记，在生物体基因组中，DNA 序列差异是生物遗传多样性的直接体现，通过研究这些差异可进行品种间亲缘关系的分析。分子标记在生物体中分布广泛，多态性高，信息量丰富，遗传稳定，利用分子标记进行种子基因分析，实验结果及时可靠，在农作物种子质量监控、品种身份鉴定、品种权保护、品种审定、基因定位和遗传育种等方面具有重要的意义。经过研究与改进，第1 代分子标记方法由于各种问题与缺陷逐渐被淘汰，目前SSR 和SNP 分子标记是农作物种子检测中应用的优良标记方法。

1 检测原理

SSR（简单重复序列）第2 代DNA 分子标记，是生物体内存在的以l～6 个核苷酸为重复单元的DNA 序列，由于寡核苷酸重复序列和重复次数不同形成长短不一的核苷酸片段。将作物品种在某一位点的特异核苷酸序列作为标记，根据核苷酸链两端保守的基因序列设计不同的引物，将这些DNA 片段扩增出来，分析比较待测样品在该位点的基因序列，确定品种基因型，分析品种间的遗传关系。SSR 标记是一种共显性标记，等位变异多，试验重复性好，数据分析简便，且易于样品间结果比对和与数据库信息比较。

SNP（单核苷酸多态性）第3 代DNA 分子标记，是指生物体内同一位点的不同等位基因之间由于插入、缺失、转换或颠换引起的单个核苷酸差异，多为转换和颠换。碱基差异是基因组中遗传变异的最小结构单位，直接导致遗传物质的不同，利用SNP 分子标记检测这种差异可以帮助区分不同品种和研究品种间的关系。SNP 标记在整个基因组中数量多，高密度分布，灵敏度高，突变频率较低，易于基因分型，是一种二态性标记，单个标记位点的区分能力较弱，需要结合多个特异位点组合形成特定指纹区分品种，要求高通量检测平台。

SSR 与SNP 标记方法中，SSR 标记是以检测品种特定位点的核苷酸片段长度作为评价依据，SNP标记是以统计分析多个位点的碱基组成变化作为分析手段。SNP 标记在生物体基因组中的密度比SSR标记高，遗传稳定性也高，在农作物种子检测中不同标记方法适合不同的检测需要，具有不同的应用价值。

2 检测平台

2.1 SSR 分子标记法检测平台SSR 分子标记法常用的检测平台有变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用4.5%或6%的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物分离PCR 扩增产物，经固定、染色后形成特异的指纹图谱，分析目标DNA 片段的迁移率，与Marker 标记条带进行比较，确定PCR 产物的大小，通过指纹信息比较待测样品和标准样品，或与数据库信息比对，确认品种信息。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台需要将待测样品和标准样品相邻泳道同时电泳，或将待测样品与相应Maker 目的条带比较，估算DNA 片段大小。这种电泳方法能比较SSR 标准指纹数据库中目前没有标准样品指纹信息的品种，不需要标准样品的DNA 作参照，但这种电泳检测方法数据精确度低，1～5bp 差异不明显[1]，自动化程度低。

荧光毛细管电泳检测平台是根据引物扩增范围和目的等位基因的分布特征将40 对引物进行分组，设立十重荧光毛细管电泳体系[2]，将不同颜色荧光标记的引物和具有自身分布特征的位点分为1 组，多重电泳。基因分析仪分离PCR 产物，数据分析软件（GeneMarker 或SSR 指纹分析器）分析待测样品在该位点的基因特征，将检测结果与SSR 指纹数据库进行比对，确定待测样品的指纹信息，分析品种身份。荧光毛细管电泳检测平台只分析检测样品，不需用标准样品的DNA 作参照，但要求该标准样品的指纹信息在SSR 指纹数据库中完整备案。荧光毛细管电泳检测平台检测结果精确，峰值图可以明显标示品种间单个位点1bp 的差异。由此可知，荧光毛细管电泳比变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到的等位基因和基因型数目多，区分品种的能力强。

2.2 SNP 分子标记法检测平台SNP 分子标记方法常用的检测平台有KASP 检测平台和芯片平台。KASP 技术是根据引物末端特异匹配的碱基进行SNP 分型，扩增时需要多个特异的SNP 引物及两个通用荧光探针和两个通用淬灭探针[3]，经过几个PCR 扩增循环后，淬灭探针已被切碎，荧光探针退火结合到新合成的、无淬灭基团的互补链上，发出荧光，通过SNP 分型仪检测荧光信号，数据分析软件KlusterCallerTM自动确定该位点上的碱基，确定品种基因型。KASP 技术通过Pherastar SNP 分型仪扫描一块1536 微孔板用时80s，时间短，效率高。

SNP 芯片是将大量特定的探针分子有序地固定在一小块硅片、玻片或硝酸纤维素膜等载体上，加入已标记的待测样品，进行杂交，扫描信号的强弱与分布，确定目的基因的种类。SNP 芯片一次能够平行分析大量基因，检测几十万到上百万个位点，且性能稳定、操作简单、检测方便。但芯片设计开发成本较高，生产工艺复杂，目前市场上还没有完善的种子质量检测SNP 芯片目录，需要定制特定的SNP 芯片，不适合小样本量检测和大范围推广应用。

SSR 与SNP 标记方法在数据分析方面各有优势，SSR 标记方法是将每份待测样品分别与40 个位点依次对应，独立分析；SNP 标记可以将所有检测样品对应1 对引物，在1 张指纹图中叠加分析，数据统计简单，更容易实现整合。

3 在农作物种子检测中的应用

3.1 SSR 技术在农作物检测中的应用王凤格等[2]用SSR 分子标记法构建了中国玉米审定品种SSR 标准指纹数据库，绘制了玉米审定品种40 对SSR 引物的等位基因分布图，为玉米种子真实性检测提供标准样品参照；盖树鹏等[4]筛选出6 对双亲互补型SSR 引物，检测6 个玉米杂交种种子纯度，能准确鉴定出样品中的自交株和异型株，与田间鉴定结果差异不显著；黄殿成等[5]从引进人才、仪器设备、试验操作、检测成本和工作效率等方面，总结种子企业应用SSR 分子标记法鉴定棉花品种真实性和种子纯度，体现了SSR 分子标记在企业经营管理中发挥的重要作用。截至2020 年，农业农村部颁布了基于SSR 标记的玉米、水稻、小麦、马铃薯等20余种作物的品种鉴定方法标准[6]，在种业领域得到了广泛应用。

3.2 SNP 技术在农作物检测中的应用北京市农林科学院玉米研究中心开发的SNP 芯片MaizeSNP3072[7]、MaizeSNP384[8]用于玉米品种真实性鉴定；中国水稻研究所开发的96 个SNPs KASP 检测和50K 个SNPs 芯片用于鉴定水稻真实性[6]；金名捺等[9]利用水稻全基因组9K SNP 芯片分析水稻栽培种黄华占和野生稻Y605，开发特异SNP 位点检测，根据基因分型，能准确区分两个品种；匡孟等[10]基于KASP技术，利用SNPline 平台从棉花63K 全基因组芯片中筛选到26个SNP核心标记快速检测棉花杂交种纯度。利用SNP 标记法鉴定水稻、玉米、小麦品种真实性3项行业标准已经通过审定[6]，棉花和油菜、大白菜等蔬菜作物的相关标准和数据库构建正在完善中。

4 小结

SSR 和SNP 两种标记方法在检测通量、数据分析和试验操作中各有优势，在不同的检测项目中发挥各自的作用。李雪等[11]对11 套玉米种子杂交种和亲本进行试验，用40 对SSR 引物和3072 个SNP位点的数据比较两种标记方法在玉米种子真实性鉴定中的应用，分析结果表明，这两种方法在种子真实性鉴定方面具有较好的一致性，且这两种标记方法在区分品种能力和位点稳定性等方面差异较小。SSR 分子标记引物数量少，适合少量样本检测，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳费时、费力，检测结果精确度低，荧光毛细管电泳自动化程度高，结果精确，但仪器设备、试剂及仪器维护成本较高；SNP 分子标记实现了位点和样本高通量检测，仪器操作智能化，试验数据易整合，但数据缺失和分型误差频率较高，购置仪器、试剂和芯片定制成本高。SSR 和SNP 两种标记方法和检测平台各有优缺点，今后应积极发挥SSR 标记的灵活性，继续开发SNP 技术的优势，适应市场需要。随着分子标记技术的不断优化完善和检测成本的逐渐降低，两种标记方法在农作物种子检测中将有更广阔的应用前景。