鼠疫疫苗研究进展

匡 衡，蔡 欣综述，汪茂荣审校

0 引 言

鼠疫是鼠疫耶尔森菌引起的一种严重的人畜共患传染性疾病，在我国属于甲类传染病。人类历史上有记载的流行出现过3次，造成了数亿人的死亡。第3次鼠疫流行开始于18世纪，并持续至今[1]。近几年来，鼠疫疫情时有爆发，2017年8月马达加斯加鼠疫疫情爆发，感染者高达数千人，其中大部分为肺鼠疫。2019年11月12日北京确诊2例肺鼠疫病例，11月15日内蒙古确诊1例腺鼠疫病例。2020年7月5日，内蒙古1名牧民确诊为腺鼠疫，8月2日包头市发现1例死亡病例，经会诊确诊为肠型鼠疫，死亡原因为循环系统衰竭；8月6日包头市发现一起腺鼠疫病例，患者于8月7日凌晨死亡。目前，鼠疫治疗以链霉素为主的抗生素进行治疗，但近年来发现鼠疫耐药菌甚至是多重耐药菌，加之恐怖分子可利用耐药鼠疫耶尔森菌制作生物武器，对人类造成生命威胁，因此，鼠疫疫苗的研发与临床应用显得尤为迫切。早在19世纪末，Alexandre Yersin在香港发现了鼠疫耶尔森菌，并在数年后研制出了第一剂鼠疫疫苗[2]。目前为止，鼠疫疫苗的种类主要有减毒活疫苗、亚单位疫苗、结合疫苗和DNA疫苗等，但由于安全和保护效力问题，国内仅有少数疫苗上市。本文就鼠疫疫苗的研发情况作一综述。

1 减毒活疫苗

目前国内上市的鼠疫疫苗大多为EV76减毒活疫苗，EV76是1926年从马达加斯加获得的鼠疫菌株，经过数年培养后减弱了毒性，并投入临床使用。在对EV76菌株不断培育和传代中，人们发现pyrE基因是EV76菌株的一个突变热点，这可能对研发新型EV76疫苗有所帮助[3]。脂质A是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的疏水性锚点，是LPS的毒性和生物学活性的主要组分，LPS通过细胞表面的TLR4通路激活细胞。而鼠疫耶尔森菌在37℃下合成一种TLR4通路无法识别的四酰化脂质A，以此来逃避先天免疫反应，在低温下，lpxP表达，生成六酰化脂质A，激活TLR4通路[4]。Sun等[5]将大肠杆菌lpxP基因导入鼠疫耶尔森菌染色体中，以免由于细菌丢失质粒导致毒性，构建了χ10015菌株，使其毒力大大降低。Χ10030菌株是将△Pcrp21::TT araC PBAD crp突变导入χ10015菌株得到，接种小鼠后诱导了高水平的IL-10，并在动物实验中证实了其比χ10015菌株更强的免疫原性和更低的毒性。2020年，Wang等[6]从KIM10(pKD46)中去除质粒pKD46，得到YPS19菌株，再在YPS19上引入DlacI::Plpp lpxE突变，得到YPS20菌株。YPS20比YPS19极大降低了毒性，但YPS20的脂质A去磷酸化失去了在pgm位点上调毒力因子的能力，导致YPS20肌内注射不能为小鼠提供任何保护。因此，合成六酰化脂质A的YPS19菌株具有进一步的研究价值。

LcrV蛋白是一种鼠疫耶尔氏菌抗原，作为一种多功能蛋白质，通过与负调控因子LcrG结合，并与YopB和YopD一起，影响效应子的分泌并进入真核细胞。LcrV也可作为鼠疫杆菌分泌系统的针帽蛋白与n -甲酰肽结合[7]。LcrV具有高度的免疫原性，可诱导保护性免疫反应，升高IL-10，降低肿瘤坏死因子α，是许多疫苗的重要组成部分[8]。重组减毒沙门氏菌RASV，由Branger等[9]于2009年构建，RASV合成了LcrV的截断形式——LcrV196。在动物实验中，单独使用RASV可为小鼠提供完全的保护，可能是由于RASV产生免疫原性交叉保护抗原，而LcrV的保护作用并不显著。在2016年，Sanapala等[10]优化了(RASV) Χ12094，使小鼠口服后产生高水平LcrV, Psn和F1抗体，对皮下及鼻内接种鼠疫杆菌的小鼠起到完全保护作用，而且未观察到对小鼠的毒性作用。这种基于RASV的三价疫苗可进一步研究其对人体的安全性及免疫能力，经过临床验证后未来有望成为下一代鼠疫疫苗。

2015年，van Lier等[11]通过高通量标记诱变法获得了50 088个鼠疫耶尔森菌株C092的突变体，并在肺鼠疫小鼠模型中用野生型鼠疫杆菌CO92进行筛选，获得了Δlpp ΔmsbB Δail和Δlpp ΔmsbB::ailL2两株突变体，Δlpp ΔmsbB Δail突变株删除了编码基因LPP，乙酰转移酶MsbB和附着入侵位点Ail的基因，而Δlpp ΔmsbB::ailL2包含毒性减弱的Ail基因。Tiner等[12]检测了这两株突变体，并新建了突变体Δlpp ΔmsbB Δpla，Δlpp ΔmsbB Δpla未删除Ail而是删除了纤溶酶原活化蛋白酶(plasminogen activating protease，pla)基因，在小鼠肺鼠疫模型中，接受Δlpp ΔmsbB Δail和Δlpp ΔmsbB Δpla免疫的小鼠均有80%～100%的存活率，分别接种两种疫苗的大鼠也均获得长期的体液和细胞介导免疫反应。由于Δlpp ΔmsbB Δail突变体被美国疾病防控中心排除在预防选择代理列表外，Δlpp ΔmsbB Δpla突变株可能成为鼠疫疫苗的重点研究对象，而Δlpp ΔmsbB Δail突变体也并非无研究价值。

2 亚单位疫苗

亚单位疫苗相对减毒活疫苗要有更高的安全度。Leary等[13]将表达鼠疫F1与V抗原的基因融合并连接入pUC18中，得到的质粒可表达F1与V抗原的融合蛋白。在小鼠动物实验中，单独应用融合蛋白和F1与V抗原联用的保护作用相似，但明显优于单独使用Fl或V抗原的保护效果。F1-V亚单位疫苗通常使用铝制凝胶作为佐剂，这种佐剂通常诱导辅助性T淋巴细胞2(helper T lymphocytes 2，Th2)调节的体液免疫，在免疫效果方面不如体液免疫与细胞免疫的同时保护[14]。Dinc等[15]发现了一种新型佐剂SA-4-1BBL，该佐剂促进CD4+和CD8+T细胞产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干扰素(Interferon，IFN)，增加了Th1诱导的细胞免疫应答。在皮下接种鼠疫杆菌的小鼠模型中，接种SA-4-1BBL连用铝制凝胶作为佐剂的F1-V亚单位疫苗的保护效果要优于使用单一佐剂的疫苗。但在肺鼠疫小鼠模型中，尽管SA-4-1BBL增加了细胞免疫的产生，但对雄鼠未产生更好的保护效果，因此SA-4-1BBL增加免疫疗效的结论仍有待商榷。SA-4-1BBL强大的刺激细胞免疫效果不仅可使用在F1-V亚单位疫苗上，对其他亚单位疫苗，尤其是针对细胞内病原体的疫苗可能更有效果。在开发F1-V亚单位疫苗上，新型佐剂的研发可能尤为重要。Gregg等[16]通过细菌酶组合化学合成的新型TLR4配体辅助化合物BECC438作为一种新型佐剂，BECC438引起平衡的IgG1/lgG2c应答，在体外诱导细胞因子谱，诱导高抗菌素特异性免疫滴度和Th1相关的IgG2c免疫滴度，在动物模型中，使用BECC438作为佐剂的F1-V亚单位疫苗也成功保护了腹腔接种鼠疫杆菌的小鼠免于死亡。新型佐剂的研发可以有效解决亚单位疫苗免疫方式单一的问题，随着各种佐剂的研发使用，亚单位疫苗在鼠疫免疫上有着很大潜力，目前亚单位疫苗主要研究对象是F1-V抗原，其他鼠疫抗原则少有研究，基于F1-V的二价或多价疫苗可能更有研究价值。

为降低LcrV的活性，北京市微生物与流行病学研究所通过在载体pET24a中插入rV270-凝血酶-六氧嘧啶融合基因，或在载体pET32a中插入六氧嘧啶-肠激酶-rV270或六氧嘧啶- Xa-rV270融合基因制备了一种重组LcrV的变种——rV270蛋白。他们将F1与rV270混合，加入铝制凝胶作为佐剂，制备了F1 + rV270亚单位疫苗[17]。在一个长期的动物实验中，雌性BALB/c小鼠免疫后539 d依然可以检测出F1和rV270抗体，该疫苗可以维持一个长时间的体液免疫[18]。尽管F1+rV270亚单位疫苗仍然在研发中，只要提高其免疫效果，验证安全性，接种这种亚单位疫苗就有可能成为未来人类免疫鼠疫的主要方式之一。

3 结合疫苗

结合疫苗通常由鼠疫杆菌保护性抗原与活载体结合得到，由于需要使用活载体，必须精确衰减载体毒性，过高的衰减会降低载体诱发免疫的能力，降低表达保护性抗原的水平，而过低的衰减则会导致人体产生并发症。尽管研发难度较高，结合疫苗强大的免疫作用和易于大批量生产的特点使得结合疫苗一直是鼠疫疫苗研发的热点。

牛痘病毒是天花的疫苗，也是许多传染病和癌症的常用疫苗载体，人体单次接种牛痘病毒可以获得数十年的T细胞免疫应答[19]。Embry等[20]使用重组ACAM2000牛痘病毒构建了可表达LcrV-TM蛋白的LcrV-TM病毒株，通过电镜检查，发现LcrV-TM蛋白表达在成熟病毒粒子的表面，接受该疫苗免疫的小鼠在接种15倍半数致死量的鼠疫杆菌后，5 d存活率达100%，而仅接受LcrV蛋白免疫的小鼠存活率只有20%，由此推断，牛痘病毒可有效提高传递抗原的效率，更好的诱导免疫应答。

腺病毒载体是一种转导效率极高的病毒载体，由于其转导入细胞内后不整合到宿主细胞染色质，仅在细胞核内染色之外进行表达，所以拥有很高的安全性，被证明具有佐剂活性以及促进细胞免疫的能力，在基因治疗方面被广泛应用[21]。在2008年，Sofer-Podesta等[22]合成筛选并纯化得到了腺病毒介导的产生LcrV抗原的疫苗AdαV，通过蛋白质印迹法分析，接种疫苗小鼠血清中迅速出现LcrV抗原，发生免疫反应。对暴露前6 h，暴露时和暴露后6 h的小鼠进行免疫，小鼠平均存活率为93.7%，证明AdαV在暴露前后均有疗效。2016年，Sha[23]等将融合基因YFV(包括ycsF、caf1和lcrV)导入一种复制缺陷的人5型腺病毒载体中，得到了rAd5-YFV三价疫苗，并在食蟹猴模型中提供了100%的保护，这种疫苗已经进入临床研究阶段。腺病毒载体能否搭载更多鼠疫抗原还未被研究，更多高价疫苗可能对鼠疫杆菌，尤其是耐药性鼠疫杆菌有更好的免疫效果。

4 DNA疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗，是将外源基因直接注射到体内进行表达，从而引起细胞或体液免疫的疫苗。DNA疫苗单次接种后可持续较长时间，能同时诱导体液免疫与细胞免疫，拥有较好的免疫效果，适合大批量生产，并且存储以运输方式为干粉，适合商业化[24]。2010年，Yamanaka构建了可表达F1-V 或V-Ag的淋巴细胞趋化因子(LTN)DNA疫苗LTN/F1-V和LTN/V-Ag，通过鼻腔给药时，两种DNA疫苗对小鼠保护作用不明显；通过对TH细胞光谱的比对，发现鼻腔给药影响了TH17细胞免疫效应的产生，而肌内注射DNA疫苗的疗效则要明显提高，肌内注射也是DNA疫苗主要接种方式[25]。近年来，电穿孔技术逐渐使用在了DNA疫苗中，与传统注射疫苗相比，使用电穿孔技术可使体液和细胞免疫应答增加100倍[26]。单独表达LcrV的DNA疫苗后被证明可以引起CD8+T细胞对LcrV的特定表位的免疫应答，LvrV上存在潜在的T细胞表位[27]。构建可表达F1-V-Ag的疫苗或许是接下来LTN DNA疫苗的研究方向，由于是近年来新兴的疫苗，DNA疫苗在人体上能否表达及是否安全也有待研究。

5 结语与展望

近年来防止生化武器威胁需求不断扩大，研制新型有效的鼠疫疫苗迫在眉睫。在如今形势下，研制鼠疫炭疽等烈性传染病的混合疫苗和多价疫苗将成为趋势。灭活疫苗和减毒活疫苗可有效防治野生型鼠疫，但其不稳定的安全性和无法防治耐药型鼠疫成为无法忽视的弱点。亚单位疫苗和基于亚单位疫苗的结合疫苗是如今疫苗研制的热点，高效且安全的免疫是其主要优势，而DNA疫苗目前依然难以离开实验室，研制对人体有效的DNA疫苗任重道远。