p16/Ki67和E6/E7 mRNA在宫颈癌筛查中的研究进展（综述）

王 侠

宫颈癌目前已成为仅次于乳腺癌的女性常见恶性肿瘤之一。宫颈癌通常由低级别或高级别的鳞状上皮内病变演变而来，因此早期对女性宫颈癌筛查显得十分重要。既往的研究是基于巴氏（Pap）涂片的宫颈癌筛查，被广泛认为是最重要的策略，并在过去几十年中降低了宫颈癌的发病率和病死率[1]。随着对分子生物学和人乳头瘤病毒（HPV）研究的迅速发展，出现了一系列简便的宫颈癌筛查方法。多数筛查方法依赖于HPV-DNA的检测，其中包括第二代杂交捕获法（HC-2）、Cervista HPV HR和Cobas-HPV。这些方法具有高重复性和可接受性等优点。然而，这些基于DNA的检测方法往往因其不理想的性能而受到限制。近年来据报道，免疫组织化学或原位杂交结合细胞形态学评价可预测低级别病变，因此，适当地结合使用生物标记物可以显著地提高检测效率以促进早期宫颈恶性肿瘤的治疗效果。本综述主要总结了近五年来国内外宫颈癌筛查指标p16蛋白、Ki67蛋白、E6/E7 mRNA以及联合检测的相关研究进展，以期在病理方面探寻更佳的宫颈癌筛查方法，为了在浸润性癌发生之前发现并治疗宫颈上皮内瘤变（CIN），降低宫颈癌转诊率，提高临床诊疗效率。

1 p16/Ki67在宫颈上皮内瘤变中的诊断价值

p16INK4a（p16）是一种在细胞周期调控中起关键作用的抑癌蛋白，是继p53之后第二常见的肿瘤抑制基因。p16的过度表达被认为是E7表达不受调控的替代标志物，也作为人类乳头状瘤病毒（HPV）感染的指标，在HPV相关肿瘤中高表达[2]。Ki67是一种细胞增殖标志物，近年来被发现其作为分子标志物用于不同肿瘤细胞诊断治疗与预后[3]。生理条件下p16和Ki67蛋白的表达不会共同发生，因为它们通常具有相互排斥的表达效应。当宫颈上皮内共同表达p16与Ki67时，可能出现细胞周期调控失常。因此，在传统诊断方法的基础上，可以通过生物标记物来提高宫颈癌筛查的准确性，特别是转化型HPV感染。Ruiyi Zhang等[4]研究表明在CIN2检测中p16/Ki67双重染色的特异性为68.33%，显著高于细胞学（38.33%）和HRHPV检测（21.67%）。在不典型鳞状细胞病变中，p16/Ki67双染的特异性显著高于HPV检测，敏感性却与HPV检测相似。对于HR-HPV阳性CIN2的敏感性和特异性均高于细胞学和 HPV16/18检测。因此，p16/Ki67双染实验提高了CIN2检测的特异性，相应地减少了阴道镜转诊。Qiu-Ping Qian等[5]发现双染具有很高的重复性，且联合检测液基细胞学和p16/Ki67双染色显示出最高的特异性，这种方法可用于那些潜在受宫颈癌影响的患者的分类诊断中。此外学者们提出不同阳性率的p16/ Ki67的表达对CIN分级具有较高的诊断价值，随着CIN分级的提高，阳性表达率呈现出逐渐上升的发展趋势，且联合诊断的敏感性、特异性以及准确率均高于单独使用p16诊断宫颈鳞状上皮内病变[6]。此外，研究发现液基细胞学联合p16/Ki67用于诊断宫颈上皮内瘤变的准确率和敏感性显著高于单独检测组[7]。由此可说明p16/Ki67分子标志物可以反映宫颈上皮内瘤变的分级，且不同级别表现出不同的特异度。

2 E6/E7 mRNA在宫颈上皮内瘤变中的诊断价值

E6/E7基因的表达是HPV持续感染和宫颈恶性转化的必要条件。在宫颈上皮细胞癌变过程中，HPV将其E6/E7 DNA整合到宫颈上皮细胞基因组中，使上皮细胞获得癌基因，在致癌因子的作用下被激活，转录成E6/E7 mRNA，并且进一步翻译成癌蛋白E6/E7，它们分别与抑癌蛋白P53和PRB结合，导致P53和PRB失活，最终导致宫颈癌的发生。因此，HPV E6/E7 mRNA检测不仅可以提示HPV感染，而且可以在一定程度上反映E6/E7基因的表达和病变程度。Ren C等[8]发现HPV E6/E7 mRNA的表达水平是高级别CIN和宫颈癌的危险因素。HPV E6/E7 mRNA定量分析对ASCUS巴氏涂片的诊断具有较高的敏感性和特异性。E6/E7mRNA定量检测作为ASCUS患者的分型试验具有较高特异性，可降低为阴道镜检查的低转诊。Yang L等[9]通过meta分析指出HPV E6/E7 mRNA阳性作为一种不良的预后因素提示意义不明确的非鳞状上皮细胞（ASCUS）的女性处于危险状态，应及时做阴道镜转诊并加强随访。而HPV E6/E7 mRNA阴性的女性可综合考虑个体差异，减少不必要的阴道镜检查，减轻患者的心理负担。此外，采用HPV RNA荧光原位杂交技术也可以提高CIN诊断形态学不明确病例的准确性[10]。如前所述，p16/Ki67的存在是HPV相关宫颈癌中HRHPV感染的替代标记物。然而，p16INK4a往往导致对染色结果评判的偏倚，而Ki67在宫颈癌中的诊断价值尚不明确。因此Chen T等[11]研究表明与p16和Ki67免疫双染相比，HR-HPV E6/E7mRNA原位杂交技术宫颈癌具有高度的敏感性和特异性。然而最新的研究发现，薄层液基细胞学检查（TCT）联合人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测的灵敏度和特异度高于单独检测组，具有较高的临床筛查价值[12]。总之，HPV E6/E7mRNA定量检测有望解决HR-HPV DNA检测特异性低的ASCUS巴氏涂片分流问题，避免不必要的阴道镜检查和活检，降低患者的医疗费用，减少医疗资源的浪费。

3 联合检测p16/Ki67与E6/E7 mRNA在宫颈上皮内瘤变中的诊断价值

近年来国内学者发现HPV E6/E7 mRNA和p16/ki67免疫细胞化学双染检测有一定的临床意义，两者进行联合检测明显提高了分流诊断的灵敏度和特异度。此外，相比于单独检测，联合应用明显提高了CINⅡ(+)病变的灵敏度，提高了筛查效率，具有一定的临床应用价值[13]。然而Zhu Y等[14]发现p16/Ki67免疫细胞化学和HPV E6/E7 mRNA检测都比HPV DNA检测有更高的特异性，而p16/Ki67免疫细胞化学比HPV E6/E7 mRNA检测具有更高的敏感性。针对两者联合检测对宫颈癌筛查及分型仍需进一步探索。

p16基因是一种肿瘤抑制基因，位于人类第9号染色体上，其产物p16蛋白在细胞增殖与分裂过程中发挥负调控作用。许多文献指出，p16蛋白在不同宫颈上皮内瘤变中存在差异，且与CIN病变程度呈正相关。此外，p16表达水平与HPV感染密切相关。Ki67是一种与细胞周期密切相关的细胞核增殖性抗原，被发现可能与肿瘤发生密切相关，并反映肿瘤细胞增殖活性[15]。临床上人们通过实验证明p16/Ki67双染对宫颈上皮内瘤变的诊断意义较大，具有较高的敏感性与特异性，可推荐在临床上用于CIN分级诊断。

高危型HPV持续感染状态被认为是宫颈癌的最主要病因。HR-HPV的基因组参与病毒自身的复制、转录、翻译等过程，其晚期区负责编码HPV衣壳蛋白，在上皮细胞的内吞过程中发挥重要作用。E6蛋白作用于p53基因，控制基因表达过程中的各个环节。E7基因编码的蛋白主要是结合到肿瘤抑制蛋白Rb上而引起了Rb降解，导致E2F转录因子以游离形式存在，激活参与细胞周期的相关基因，最终导致细胞呈增殖状态。宫颈HPVDNA检测阳性只能表明病毒存在，而HPV E6/E7 mRNA检测阳性可说明病毒已整合入宫颈上皮细胞基因组内并发生了基因表达，处于持续性感染的状态。宫颈上皮内病变患者存在HPV E6/E7 mRNA异常高表达，且宫颈上皮内病变分级是宫颈锥切术后疾病持续复发的高危影响因素，可随病变程度的增加而上升，因此，高级别宫颈上皮内病变发生宫颈癌的危险性较大。Pruski D等[16]研究发现高级别鳞状上皮内病变与HPV E6/E7 mRNA阳性密切相关，故HPV E6/E7 mRNA是鉴别肿瘤病变和宫颈癌相关性的重要依据且检测灵敏度和特异性随着年龄的增长而增加。

4 小结与展望

诊断早期宫颈癌的不可或缺的环节是宫颈上皮内瘤变。因此，早期发现宫颈上皮内瘤变对预防宫颈癌极其重要。目前国际公认准则采用三阶梯宫颈癌筛查程序，即宫颈涂片细胞学检查、阴道镜检查、宫颈组织病理学检查，使得宫颈癌的检出率显著提高。然而宫颈脱落细胞学检查往往根据病理科医师自身经验进行诊断，具有主观性，易造成假阳性或假阴性。组织活检虽作为诊断宫颈病变的“金标准”，但属于有创检查，不利于大面积筛查。本综述旨在总结近年来临床上宫颈癌筛查中常用的简便可靠的分子标志物的特点及临床应用价值，目的是为临床宫颈癌筛查提供重要的分子诊断依据。检测HPV E6/E7 mRNA对早期诊断宫颈癌具有重要意义。然而，学者们并不仅仅局限于这几类标志物的检测[17]，越来越多用于宫颈癌筛查的生物标志物将被逐步发现并应用。通过检测p16/Ki67、HPV E6/E7 mRNA，探讨其在宫颈癌筛查中的作用，从而了解分子生物学技术用于宫颈癌筛查与早期诊断，为临床应用提供了坚实的理论依据。