利用CRISPR_Cas9技术创建拟南芥Argonaute2基因缺失突变体

李红英，高延武，于茹恩，王政博，李雪萍，刘龙昌

(河南科技大学 园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023)

RNA沉默(RNA silencing)是真核生物中广泛存在的一种内源基因的表达调控机制，也是植物中主要的防御体系[1-2]。ARGONAUTEs(AGOs)蛋白是RNA沉默诱导复合体(RISC)的核心蛋白[3]，协同小分子RNA在转录水平(transcriptional gene silencing，TGS)或者转录后水平(posttranscriptional gene silencing，PTGS)靶向修饰DNA或者沉默RNA[4-5]，产生特异性基因沉默作用，被称为RNA沉默效应的执行者。不同植物AGO数量差别较大，基于蛋白相似性的进化关系可归为3个进化分支：AGO1/5/10、AGO2/3/7和AGO4/6/8/9，单子叶植物水稻和玉米的AGO18单独归为一支[6]。其中，AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7和AGO10已被证明在植物抗病通路中发挥重要作用[7]，并且AGO成员之间也会产生相互作用进而影响功能[8-9]。

基因编辑是近几年快速发展起来的对基因组靶序列进行精确编辑的一种技术。该技术可以对目的基因进行碱基插入、缺失等定点编辑，产生特定基因功能失活突变体，从而为生物体功能基因组学研究提供优质遗传材料。源自细菌适应性免疫系统的CRISPR_Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromicrepeats /CRISPR-associated nuclease，Cas9)是第3代基因组编辑技术，具有高效、便捷、成本低廉、能够实现全基因组编辑和多靶点编辑等优点[10-11]。该技术通过在目标物种基因组DNA上选择需要改造的基因靶点，设计向导RNA (single-guide RNA，sgRNA)，然后连入Cas9基因构成表达载体，转入受体细胞，转录出sgRNA，通过碱基互补配对方式引导核酸内切酶Cas9蛋白靶向结合到基因组DNA目标基因靶点，使其产生双链断裂，然后通过非同源末端连接或同源重组的修复方式，引起目的基因突变，从而实现基因组靶目标位点的编辑[12]。

突变体是植物基因功能研究的重要材料，要精确解析每个基因的功能与基因间的相互作用，必须分析单个基因和多个基因的突变表型，以及它们的时空表达剖面[13]。模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)有10个AGO蛋白成员[14]，借助丰富的拟南芥T-DNA插入和点突变等多种强突变体和弱突变体，AGO1(At1g48410)成为研究最为透彻的AGO蛋白[15]。近年来发现AGO2(At1g31280)在植物抵御病毒入侵中相比其他AGO蛋白可能具有更多样化的抗病毒能力[8]，但具体机制还不清晰。atago2-1突变体还表现出对细菌性病害的不耐受[16]，深入研究揭示AGO2可通过调控精胺酸甲基化调节细菌免疫[17]。最近研究还发现，AtAGO2可结合MUG13.4蛋白参与调控盐胁迫响应[18]，表明AGO2的多样性角色。相比AGO1，拟南芥AGO2突变体类型和数量均较少。已报道的拟南芥AGO2研究多采用欧洲拟南芥突变体中心提供的T-DNA插入突变体，突变类型比较单一，并且外源T-DNA插入突变体随着繁殖代数的增加容易产生外源T-DNA基因沉默。因此，本研究拟利用最新基因编辑技术，构建AGO2基因CRISPR_Cas9敲除载体，并转化拟南芥，获得可稳定遗传的AGO2基因苷酸缺失/插入类型突变体，为后续AGO2抗病和发育调控功能研究提供不同突变类型的遗传材料。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥(A.thaliana)：哥伦比亚生态型种子(Columbia，Col-0)，由河南科技大学园林实验中心保存。pYLCRISPR/Cas9-DH植物表达载体系统由华南农业大学刘耀光教授馈赠。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101感受态细胞和大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

PCR扩增酶PrimeSTAR、DNA分子量标准品、质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和PCR产物片段纯化试剂盒等购自Takara公司。限制性内切酶BsaⅠ和T4 DNA连接酶购自NEB公司。pTOPO-Blunt Simple克隆载体购自北京艾德莱生物科技有限公司。LB培养基各成分、MS粉、抗生素等生化试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1AGO2基因编辑靶点选择与gRNA引物设计

基于拟南芥基因组数据库(TAIR10，http://www.arabidopsis.org)，利用在线工具CRISPR-GE[19](http://skl.scau.edu.cn/)查找拟南芥AGO2(AT1G31280)包含Cas9识别位点PAM序列的片段，以PAM序列之前20 nt的序列作为编辑靶位点序列，根据靶点位置、GC含量和网站预测的脱靶率确定靶点。为了降低脱靶率，进一步选择候选靶序列所在位置上下游各50 bp，利用NCBI网站Blast工具进行同源性搜索比对。之后使用CRISPR-GE子工具“primerDesign”进行靶点接头引物设计，并由上海英骏生物技术有限公司合成，纯化方式为iPAGE，序列如表1所示。

将每个靶点的接头引物用TE溶解成100 μmol·L-1母液，各取1 μL正反向靶点引物加入到98 μL TE混合稀释为1 μmol·L-1。在PCR仪中90 ℃ 反应2 min拿出，室温自然冷却完成退火，得到靶位点双链结构靶片段，末端磷酸化处理后以备下步中间载体构建使用。

1.3.2 AGO2靶点片段扩增、sgRNA表达盒构建与扩增

本套CRISPR_Cas9载体系统包含了双元的植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-DH和针对T1到T3的3个sgRNA表达盒中间载体，前者以CaMV35S启动子表达Cas9，后者分别以AtU3b、AtU3d和AtU6-1 3个启动子驱动sgRNA的表达。首先利用同时酶切和连接方法，在3个PCR反应体系中分别加入BsaⅠ内切酶约5 U、T4 DNA连接酶约30 U、sgRNA表达盒中间载体20 ng，以及对应靶点的正反向接头引物各0.05 μmol·L-1，混匀后离心，置于PCR仪中；37 ℃ 5 min，20 ℃ 5 min，5个循环；将3个靶点分别连入AtU3b、AtU3d和AtU6-1 3个启动子驱动的表达盒中。然后利用克隆框接头引物U-F/靶点接头反向引物配对，靶点接头正向引物/克隆框接头引物gRNA-R配对，以上一步获得的表达盒为模板，进行第一轮PCR扩增，然后每个靶点分别取2 μL扩增产物等量混合作为模板，再利用3对位置特异引物Uctcg-B1′/gRctga-B2、Uctga-B2′/gRaaga-B3、Uaaga-B3′/gRcggt-BL，分别扩增出含3个靶点片段的gRNA表达盒。扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，利用PCR产物纯化试剂盒纯化，NanoDrop超微量分光光度计测定浓度后备用。

1.3.3 双元表达载体构建

利用Golden Gate cloning方法[20]，采取边酶切边连接策略，在15 μL反应体系中加入上一步获得的PCR纯化产物50 ng，pYLCRISPR_Cas9-DH载体100 ng，以及10 UBsaⅠ内切酶和30 U T4DNA连接酶，进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的连接组装。反应条件为37 ℃ 2 min，10 ℃ 3 min，20 ℃ 5 min，15个循环；37 ℃保持2 min。取部分连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂在含50 μg·mL-1卡那霉素LB固体培养基上进行筛选培养，然后挑取单菌落送上海英骏生物技术有限公司测序，将连接成功的克隆提取质粒保存。

1.3.4 拟南芥遗传转化

将构建好的表达载体通过液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，涂平板后置于28 ℃倒置培养2 d，挑取单克隆于LB液体培养基(含50 μg·mL-1卡那霉素和17 μg·mL-1利福平)振荡培养，利用花序浸染法[21]转化拟南芥植株，培养至种子成熟后收种。

1.3.5 转基因植株筛选与鉴定

将收获的种子自然干燥，用75%乙醇进行表面消毒后均匀播撒在含25 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS固体培养基平板上，置于4 ℃放置72 h，然后于光照培养条件下筛选，15 d后根据幼苗根生长情况统计抗性苗数量，并移栽至育苗土中继续培养。待苗长至6片真叶后，取部分叶片采用CTAB法提取基因组DNA，同时提取野生型叶片作为阴性对照。利用潮霉素基因片段引物Hyg-F/R(表1)进行PCR检测。

表1 引物序列

1.3.6 转基因植株靶位点编辑情况检测

以10株长势良好的阳性转基因植株基因组DNA为模板，根据靶点所在片段设计上下游引物C9AtAGO2-seq-F和C9AtAGO2-seq-R(序列如表1所示)，PCR扩增AGO2基因包含靶位点的目标DNA片段。PCR扩增产物回收纯化后连接到克隆载体上，转化后涂平板，每个平板挑10个单克隆进行测序。利用DNAMan对所有测序获得的序列和拟南芥参考基因组AGO2基因序列进行比对分析，并进行统计。

2 结果与分析

2.1 sgRNA靶点序列选择与sgRNA引物设计

从TAIR数据库下载拟南芥AGO2(AT1G31280)基因组DNA序列和CDS序列，对其基因结构进行分析。结果显示，拟南芥AGO2共有5个功能结构域(图1)。拟南芥AGO家族中共有10个成员，为了避免脱靶敲除该家族其他成员，对其蛋白序列进行了比对分析(结果未显示)，选择该基因5′端保守性较差的外显子序列为目标进行靶点设计。参照CRISPR-GE在线工具使用说明，将AGO2基因DNA序列上游约1 000 bp长度输入targetDesign子工具，并调整相关参数，选择PAM类型为NGG，靶点长度设为20 bp，对给出的潜在靶点列表进一步按照“脱靶可能性”进行排序，且GC含量大于50%，最终选定3个序列为靶点序列，分别为T1：5′-ATGGAGAGAGGTGGTTATCG-3′；T2：5′-TCCGTCCACCAGCACCACCG-3′；T3：5′-GCCACAACTCCGCCTCTATC-3′。3个靶点分别位于AGO2基因起始密码子ATG后第一和第二个外显子上(图1)，跨度约850 bp。

图1 AtAGO2基因结构与敲除靶点位置信息Fig.1 Structure of AtAGO2 and location of target sites

2.2 sgRNA克隆框连接与扩增

将每对靶点引物分别进行变性退火后形成的引物二聚体，通过酶切连接方法依次插入拟南芥来源的3个small nuclear RNA启动子AtU3b、AtU3d和AtU6-1后，再利用2轮巢式PCR扩增得到特异性目标产物，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(图2)显示，目的条带符合预期，其中AtU3b-gRNA、AtU3d-gRNA、AtU6-1-gRNA电泳条带大小分别约为284 bp、507 bp和487 bp。

2.3 植物双元表达载体pYLCRISPR/Cas9-DH-AtAGO2的构建

通过BsaⅠ切除pYLCRISPR/Cas9-DH载体(潮霉素抗性)上的ccdB片段，同时在酶切体系中加入T4连接酶进行连接反应，将上一步获得的3个靶点表达盒扩增产物连入线性化的pYLCRISPR/Cas9-DH载体，构建的表达载体转化大肠埃希菌后经菌落PCR鉴定，初步确定目标片段连入表达载体；挑取单克隆进行测序，分别与3个靶点序列进行比对，确定CRISPR敲除载体构建成功(图3-a)。将其命名为pCC9AtAGO2，载体结构如图3-b所示。

M，DL 2000 marker；T1，靶点1；T2，靶点2；T3，靶点3。M， DL 2000 marker; T1， Target site 1; T2， Target site 2; T3， Target site 3.图2 AtAGO2 3个靶点sgRNA表达盒PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测Fig.2 Gel electrophoresis detection of PCR amplification products of three target sgRNA expression cassettes

a，pCC9AtAGO2质粒靶位点测序；b，pCC9AtAGO2载体结构示意图。a， Sequencing of target sites of pCC9AtAGO2; b， Structure of pCC9AtAGO2.图3 pCC9AtAGO2质粒靶位点序列与载体结构示意图Fig.3 Sequence of target sites and structure of pCC9AtAGO2 vector

2.4 拟南芥转化与抗性苗筛选结果

将重组表达质粒pCC9AtAGO2转化农杆菌感受态GV3101后，挑取单克隆进行PCR鉴定，并通过花序浸染法转入拟南芥，对T0代转基因种子进行潮霉素抗性筛选，共获得62棵T1代抗性苗。使用潮霉素基因特异片段进行PCR扩增检测。结果(图4)显示，除少量抗性苗未扩增出条带外，共计有53株成功扩增出约700 bp目的条带，表明成功转化53棵转基因植株。

M，DL 2000 DNA marker；1～19，转基因拟南芥潮霉素抗性阳性苗；wt，野生型。M， DL 2000 DNA marker; 1-19， Positive seedlings of transgenic lines with hygromycin B tolerance; wt， Wild type.图4 部分抗性苗潮霉素基因特异片段PCR扩增检测Fig.4 PCR amplification detection of hygromycin B gene in T0 transgenic plants with hygromycin B tolerance

2.5 AtAGO2突变体检测

为了验证构建的pCC9AtAGO2基因编辑载体是否具有打靶效应，能否在预期设计的靶位点处产生基因组DNA序列的编辑，对转基因T1代植株AGO2基因靶序列进行测序分析。包含3个靶点的引物C9AtAGO2-seq-F和C9AtAGO2-seq-R PCR扩增片段预期大小868 bp(图5)，PCR产物连入克隆载体。单克隆测序结果表明，随机选择的10株转基因材料中，第1个靶点附近6株产生了编辑，第2个靶点附近10株全部成功编辑，第3个靶点所测材料均未发生编辑。其中，4株材料的第2个靶点对应的克隆测序检测到野生型带型(#2、#41、#49和#54)，说明可能为杂合型。进一步对全部发生编辑的前2个靶点的所有克隆进行比对分析，结果显示，第1靶点和第2靶点均产生了多种编辑形式的多态，其中以PAM前删除或者增加1个碱基的形式出现频率较高，同时也检测到删除10～40个碱基的编辑形式，最长可删除106个碱基(图6)。突变类型以缺失突变方式较多，缺失数目较为随机，也有出现个别位点碱基转换或者颠换的情况。

M，DL 2000 DNA marker；#2～#54，转基因T1代植株。M，DL 2000 DNA marker; #2-#54， T1 transgenic plants.图5 部分转基因T1代植株AGO2基因编辑靶点所在DNA片段PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification of AGO2 gene fragments containing editing target sites of selected transgenic lines

a，靶点1编辑形式；b，靶点2编辑形式。a， Editing forms of target T1; b， Editing forms of target T2.图6 部分转基因T1代植株AGO2靶点编辑形式Fig.6 Editing forms of AGO2 target site of selected T1 transgenic progenies

3 结论与讨论

本研究采用CRISPR_Cas9基因沉默技术创制拟南芥突变体，利用3个位点特异的sgRNA对AGO2基因进行靶向编辑。基于刘耀光课题组开发的CRISPR_Cas9系统[22]，成功构建了AGO2基因编辑载体，并转入拟南芥中，载体抗性特异引物检测表明，筛选得到T1代阳性苗53株。随机挑选10个转基因单株，利用特异引物将包含靶点序列的DNA片段扩增后构建克隆，并挑取多个克隆进行Sanger测序，结果表明，成功获得了有效的AGO2基因核苷酸缺失/插入突变体，且有多种形式的突变。

AGO蛋白是RNA沉默通路中的重要蛋白，多个成员已被证明参与到植物小RNA介导的抗病调控途径[7]，其中，AGO1和AGO2是最重要的2个成员。拟南芥AGO1是最早被发现的植物AGO蛋白，也是目前研究最为透彻的AGO蛋白；AGO2的功能近年来也逐渐受到重视。拟南芥T-DNA插入突变体ago2(SALK_003380)表现出对多种病毒和细菌的敏感性，表明AGO2在植物抗病过程中具有不可或缺的作用[7，16]，它协同AGO1作为植物抗病的第二道防线，参与次级抗病毒过程[23]。利用一种新型病毒诱导的基因沉默系统(VIGS)对拟南芥AGO2进行沉默，发现AGO2参与DCL4介导的抗病反应[24]。最近有研究利用RNAi技术特异性降低烟草(Nicotianabenthamiana)AGO2表达[25]，证实NbAGO2在病毒侵入不同阶段扮演“减速机”的角色。

利用CRISPR/Cas 9系统对二倍体植物基因编辑后，植株多产生简单突变，如纯合突变、双等位突变和杂合突变[22]。本研究靶点1获得的测序克隆结果中，仅有4株明确发生了编辑，在PAM上游位置插入或者删除1个碱基A的编辑形式出现频率较高，也有在PAM上游删除2个或者多个碱基的编辑形式出现，也有发现有对PAM本身与下游附近区域进行编辑的形式。在10株测序株系中，靶点2的克隆测序结果也显示，在PAM上游4个碱基处插入或删除1个碱基的编辑形式以高频率出现，占该位点获得克隆总数的近一半(47%)，这是CRISPR_Cas9介导的DNA双链断裂再修复过程中的常见类型[22]。部分克隆中发生了PAM位点附近区域删除10～40个碱基的短片段编辑，最长有删除106个碱基片段的编辑形式，可导致AtAGO2蛋白保守结构域的缺失，从而导致基因功能丧失。说明不同位点的编辑效果不同，同一位点的编辑类型也有较大差异。第3个靶点没有发生编辑，除了靶点的原因之外，可能跟本研究所用表达载体的编辑效率也有较大关系。有研究以现有CRISPR_Cas9载体系统为起点优化改造了相应的载体及其构建方法，操作相对简单，在单子叶植物水稻中获得了较高的转化效率[26]。

拟南芥中有10个AGO蛋白，每个AGO的单突变体都不会导致植株死亡，只有ago1功能缺失突变体表现出严重的发育缺陷[14]。本研究测序验证10株AGO2转基因植株，在第1靶点1或第2靶点发生编辑的植株共有6株为纯合体，从形态发育上看，在正常培养条件下没有表现出和野生型明显的差别(数据未显示)；之前使用T-DNA插入产生的功能缺失突变体ago2-1为材料的研究多集中于抗病相关方面，也未见有此方面的报道，拟南芥AGO2是否影响植株形态发育需要进一步确认。近期有研究在水稻(OryzasativaL.)中发现，敲除OsAGO2可导致水稻花药发育缺陷[27]，表明AGO2在植物雄株生殖发育中扮演重要角色。本研究出于试验目的考虑未对获得的基因编辑材料进行深入的表型分析和病原菌胁迫鉴定，尚未确定不同编辑形式的AGO2是否在功能上有差异。有研究报道表明，CRISPR_Cas9基因编辑载体靶向基因序列位置的不同，导致纯合突变体植株呈现出的表型也有差异[26]。与基于RNAi技术产生的突变体相比，利用基因编辑方法创制的烟草功能缺失突变体ago2表现出对多种入侵病毒比较敏感[28]，说明基于CRISPR_Cas9技术创制的遗传材料携带的基因突变形式更为多样，可为深入研究目标基因的功能机制提供丰富的遗传材料。