非洲猪瘟病毒及其分子检测技术研究进展

吕美慧，曹际娟，李海涛，郭 昕，刘 俊

(1.大连工业大学 食品学院 ，辽宁 大连116000； 2.大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605；3.天津市理化分析中心有限公司，天津 300051； 4.成都海关技术中心，四川 成都 610041)

1 流行现状分析

ASF最早于1921年在肯尼亚暴发，随后相继扩散至欧洲、中美洲、非洲和亚洲等多个国家。自2018年以来先后传播到蒙古、越南、柬埔寨、老挝、朝鲜、菲律宾、缅甸、韩国、印度尼西亚等亚太国家。由该疫病的传播范围可以发现，此病毒可以不受地域限制进行大范围传播，传染性强，世界上所有开展养猪业的国家均有感染该病毒的风险。2018年8月3日，经中国动物卫生与流行病学中心确诊，ASF在我国沈阳首次发现[10]。随后在江苏、浙江等各个省份也陆续爆发。目前疫病仍在持续中[11]。2019年3月起猪肉价格快速上涨[12]，人民生活受到一定影响。由此可见，与往年爆发的生猪疫病、禽流感等不同，ASF的传播范围更广，负面影响更大、程度更深，人民损失更重。

据中华人民共和国农业农村部报导，2020年以来，全球共有26个国家和地区发生了2197起家猪和7238起野猪共计9435起非洲猪瘟疫情。可见非洲猪瘟的传播仍在继续，对ASF的防控工作也势在必行。

2 ASF检测技术研究进展

由于ASFV的感染机制极为复杂，基因型多，目前尚未研制出有效的疫苗，只能通过捕杀患病猪切断传染源，无害化处理，从而控制疫病传播[13]。但这一方法会造成巨大的经济损失，因此对可能患病的猪群应进行早期ASFV检测从而避免扩大传染尤为重要。ASFV的快速检测主要分为两大类：一类是分子生物学检测，一类是免疫学检测。

2.1 分子生物学检测

2.1.1 常规PCR

PCR即聚合酶链式反应，是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可以看作是生物体外的特殊DNA复制[14]，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简单、迅速、对样品的纯度要求低等优点。

LUO Yuzi,Atim Stella A等[15]根据GenBank中所有ASFV的vp72基因序列的高度保守区，设计了一对特异性引物，建立了一种PCR检测方法。实验结果表明，检测限为每次反应60个DNA拷贝。特异性实验未观察到非ASF的扩增信号。对来自不同地理区域的14株代表I、V、VIII和IX基因型的14株ASFV进行检测与OIE推荐的方法相比具有足够的灵敏度与准群性。多序列比对表明，本研究中使用的引物具有足够的保守性，足以覆盖这些基因II型菌株，可以灵敏、通用地检测ASFV。

2.1.2 实时荧光定量PCR

我国在一段时期中的经济发展理念是先发展，之后再进行治理，这种模式虽然能够取得一定的经济效益，但是这也在一定程度上对生态造成了破坏。而随着生态环境的进一步恶化、水土流失和土地荒漠化的问题更加突出。因此，应该采取一定的措施进行营林护林工程的建设。在十八大的会议上，我国提出了“五位一体”建设规划，其中比较重要的内容是绿色发展的理念，这个理念的提出充分体现了我国进行生态文明建设的决心和改善生态环境建设的目标。对林地进行管理的强化不仅能够提升林场的经济效益，同时还能在一定程度上实现林业规模的扩大，为实现生态文明和经济建设提供坚实的基础。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[16]。实时荧光PCR有效解决了常规PCR只能终点监测的问题，使PCR技术得到进一步优化[17]。

曾少灵[18]等，依据ASFV的VP73基因保守序列，设计了一对特异性引物建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对，灵敏度与OIE荧光PCR方法相当，但比普通PCR方法高出至少10倍,最低检测限可达10拷贝/uL。通过对大量样品的检测得到此方法对ASF的各基因型具有普遍适用性。临床试验结果与OIE结果一致。

多重荧光定量PCR，是在PCR反应体系中加入2对或2对以上引物，达到同时扩增出多个DNA片段的目的，反应原理，反应试剂和操作过程与PCR大致相同[19]。多重荧光定量PCR为临床样品中多重病毒基因的同时检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。多种病原体在同一反应管内同时检出，既节约了时间又避免了大量试剂的浪费[20]。

Felicity J Haines等[21]，建立了一种单步、多重、实时的多聚酶链反应(RT-PCR)方法，用于同时鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV)和非洲猪瘟病毒(ASFV)以及外源性内控RNA(IC-RNA)。结合单一提取方法引物和探针组合检测三种靶核酸CSFV、ASFV和IC-RNA。实验优化后检测限为5个猪瘟病毒基因组拷贝数和22个单链抗体基因组拷贝数。这种检测方法针对目前所描述的24种ASFV基因型中的8种进行检测，有良好的特异性与敏感性。

直扩荧光定量PCR即一种无需提取DNA，直接从样品中扩增ASFV靶基因的一种荧光定量PCR方法。直扩荧光定量PCR采用了高耐受性的DNA聚合酶，不容易受样品中抑制因子的影响，无需提取核酸，因此从一定程度上降低了交叉污染的可能性，增强了该技术的检测实用性能。

张彩虹等[22]，根据ASFV的VP72基因序列，设计了一对特异性引物和探针，建立了免提取DNA直接检测样品中ASFV的荧光定量PCR方法。结果显示，对ASFV检测敏感性可达 1×10-6，与OIE推荐的荧光PCR的检测敏感相似。特异性实验与6种其他病毒未出现交叉反应。分别用建立的直扩荧光定量PCR方法和OIE推荐的传统的荧光定量PCR方法对240 份猪全血临床样品进行检测，结果显示，240份临床样品均未检出ASFV，该结果与OIE推荐的传统的荧光PCR的检测结果一致。由于未对24种基因型进行覆盖率检测，此种方法仍有待进一步研究。

2.1.3 微滴式数字PCR

微滴式数字PCR是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，每个微滴经PCR扩增后，对每个微滴逐个进行检测，根据阳性微滴的个数与比例和泊松分布原理即可得出靶分子的起始拷贝数[23]。新型的微滴数字PCR完全可以应用于ASFV的检测并且具有更高的灵敏度，并且不依赖内参基因与Ct值即可确定靶分子的数目。

原霖等[24]根据ASFV的P72基因序列，设计了一对特异性引物和探针，建立了微滴数字PCR技术，并与OIE提供的PCR技术进行对比。结果显示，该方法的最低检测限可达0.8拷贝·μL-1，敏感性高于PCR，特异性实验显示不与猪常见的6种病毒发生交叉反应，而且重复性较好。用微滴数字PCR与qPCR技术分别对78份临床病料进行ASFV的检测，两种检测方法得到的结果相同，此方法同样未对24种基因型进行覆盖率检测，所以仍有待进一步研究。

2.1.4 环介导等温扩增法(LAMP)

环介导等温扩增法是一种新型的恒温核酸扩增方法，是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63 ℃左右)保温30～60分钟，即可完成核酸扩增[25]。LAMP与PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环等过程，是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强等特点。可不依赖任何专门的仪器设备而实现快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

WANG Deguo，YU Jianghan等[26]，通过设计了以ASFV 的P10基因为靶点的引物，优化反应体系，建立了ASFV的LAMP技术。结果表明，LAMP技术能够准确、特异地检测出ASFV，检出限为6拷贝·μL-1。此技术可对ASFV的一部分基因Ⅱ型与一些未在基因库中查到的基因型有特异性。采集了240份烹调猪肉样品。其中，我们研制的ASFV核酸实时灯检测法和目测灯法均未检测出阳性，与OIE推荐的传统的荧光PCR的检测结果一致。

2.1.5 重组酶聚合酶扩增(RPA)与重组酶介导核酸扩增(RAA)

重组酶聚合酶扩增，重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物。当引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物[27]。

重组酶介导核酸扩增技术，是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在等温条件下进行核酸扩增的技术，5-20分钟就可实现仪器扩增。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶[28]。

FAN Xiaoxu, LI Lin等[29]，以ASFV的 B646L基因p72为靶点分别设计了一对特异性引物，对两种基于重组酶的等温扩增法RPA法和RAA法进行了评价。结果表明，RPA和RAA的分析灵敏度分别为每次反应93.4和53.6拷贝，且不与其他非ASFV有交叉反应。它们对所有24种ASFV基因型都具有普遍的特异性。收集了152份ASFV样本。比较了实时RPA/RAA检测与实时PCR检测的性能。实时RPA/RAA与实时PCR检测结果的一致。但相较于PCR，RAA与RPA仍存在假阳性的结果并且灵敏度较低。

2.2 免疫学检测

ELISA法即酶联免疫吸附技术，利用抗原抗体之间专一的共价结合的特性，对检体进行检测[30]。此方法适合于大量动物群体样本检测的需要,是当前在动物疫病的检疫和监测中应用最为广泛的免疫学检测技术[31]。

胶体金试纸条技术是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是在免疫渗透技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术[32]。通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色反应，检测抗原抗体。但是，目前为止，未见采用免疫学方法检测非洲猪瘟病毒的研究报道。

3 结 语

ASF是一种急性、热性的传染病，在猪群中可大范围传染，为防止此疫病在中国进一步流行，加强对此病毒检测调查和主动监测排查工作刻不容缓。OIE推荐的检测方法包括病毒分离、荧光抗体检测以及常规和实时PCR检测[33]。由于病毒分离过程复杂、耗时长，通常用于确证诊断和分子研究。中国流行的ASFV属于强毒株，感染猪一般在未产生抗体或少量抗体时已经死亡，并且在临床症状出现的两天前，受ASF感染的猪大量散播病毒[34]，所以当前检测主要针对抗原进行。在病原学检测技术中，LAMP需要四个甚至更多的引物，引物设计通常十分复杂。PCR技术具有高灵敏度，特异性，快速的优点，可以在症状出现前完成检测，是目前实验室常用的检测方法[35]。

随着国家的严格管控与人民安全意识的提高，大量养殖企业对ASF疫情进行实时监控[36]，这将使ASF在中国传播速度逐渐放缓。