林蛙油掺假分子生物学检测方法研究进展

2021-11-28陈宇飞

食品安全导刊 2021年35期

陈宇飞，杨柳

（吉林工商学院粮食学院，吉林长春 130507）

林蛙又称雪蛤，属于两栖纲无尾目蛙科[1]。林蛙油也称蛤蟆油、蛤士蟆油，为林蛙雌蛙输卵管，其主要成分是蛋白质，富含18种氨基酸[2]。林蛙油具有补肾益精、养阴润肺、健脑益智和平肝养胃功效用于调节阴虚体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗不止和痨嗽咳血等症状[3]。

哈尔滨师范大学生命学院赵文阁教授协同东北林业大学野生动物学院多名教授科学命名，把原来称做中国林蛙、中国林蛙长白山亚种的林蛙，统一命名为东北林蛙。并明确东北林蛙所产的油为“大油”，黑龙江林蛙所产的油为“小油”，其他蛙油均为“伪油”或“假油”[4]。近年来捕捉野生林蛙的人越来越多，人为的滥捕乱杀，使野生的林蛙和林蛙油越来越缺乏，导致林蛙油价格非常昂贵。一些不法商家以青蛙油、中华大蟾蜍油、牛蛙油和明太鱼精巢等冒充林蛙油，牟取暴利。常用于林蛙油掺假检测的方法有传统方法和仪器检测方法。传统检测方法有基源鉴别、性状鉴别、组织学鉴别和显微鉴别等[5]。仪器检测方法有凝胶电泳法、红外光谱法、原子吸收光谱法等[6]。随着分子生物学技术的发展，PCR、LAMP等技术的应用，使得林蛙油掺假检测能够更加快速、准确。本文对东北林蛙油掺假检测的分子生物学方法进行概括，以期为快速、准确地进行东北林蛙油掺假检测提供参考。

1 指纹图谱法

指纹图谱是基于食品的固有品质特性，运用光谱、色谱等现代仪器检测得到的能反映该食品内部特征的图谱，具有整体性、系统性、特征性和稳定性的特点[7]。李津明等[8]利用高效液相色谱法，测定10批林蛙油产品，建立指纹图谱。色谱条件为Dimonsil C18分析柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），柱温：25 ；流动相：乙腈-水（50∶50），分析时间60 min。在该色谱条件下，可以检出17个相应位置稳定的共有峰，可作为确定林蛙油的指标峰。白雪媛[9]通过高效液相色谱法对林蛙油样品进行研究，建立了林蛙油指纹图谱的共有模式，最后确定林蛙油指纹图谱的色谱条件为：Dimonsil C18（5μ 100A TiANHE®TH 1025 250 mm ×4.6 mm，S/N:06L25514）；流动相：乙腈-0.5%磷酸水溶液；柱温：室温；检测波长：209 nm；进样量为15 μL。在己筛选的色谱条件下，35 min内可完成林蛙油指纹图谱的检测，该方法具有良好的专属性、准确度、精密度、重复性和稳健性，测定范围在25～100 μg/mL。姜玢[10]以正二十四烷峰为参照物峰，确定20个共有峰，建立了中国林蛙卵油GC数字化指纹图谱。获得了以色谱指纹图谱指数F等42参数对中国林蛙卵油GC指纹图谱的超信息特征数字化评价结果和系统指纹定量法定量鉴别结果。姜玢等[11]建立了中国林蛙卵油高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）数字化指纹图谱，以亚油酸为参照物峰，确定21个指纹峰，获得了可以判别其质量的重要数字化信息，所建立的中国林蛙卵油HPLC数字化指纹图谱方法稳定、可靠，可用于中国林蛙卵油的质量控制。

2 PCR法

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种将待检验的DNA序列于生物体细胞外在酶促作用下进行扩增，设计不同物种特定基因片段的引物大量体外扩增DNA，通过得到的PCR产物而鉴别物种的技术[12-13]。李小清[14]将长白山地区的19个蛤蟆油样品进行了基源分析，研究了基于蛤蟆油近源物种的线粒体全基因序列中线粒体呼吸链特异性基因隔序建立蛤蟆油的特异性PCR鉴定方法，该方法首次建立基于线粒体基因间隔序列特异性PCR技术的蛤蟆油鉴别方法，可进行定量分析，无需通过基因测序，降低了检测成本。聂丹丹等[15]对已报道的东北林蛙、黑龙江林蛙、黑斑侧褶蛙、牛蛙和中华蟾蜍的COI及cytB基因为模板进行了研究，应用PCR扩增东北林蛙COI基因，通过测序确定东北林蛙亚种，建立了东北林蛙及其产品的鉴别方法。董瑶等[16]以林蛙和林蛙油为原料，以线粒体DNA上cytB为研究对象，应用PCR扩增cytB，并测序确定了林蛙品种，建立了林蛙种属及林蛙油基源鉴定方法。

3 “LAMP+微流控”法

环介导等温扩增技术（Loop- mediated Isothermal Amplification，LMAP）是Notomi等人在2000年建立的一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，是在65 恒温条件下进行核酸快速扩增，利用2条特异性内引物和2条特异性外引物识别靶基因上的6个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，数十分钟即可完成核酸扩增[17]。

LMAP技术是一种特异性强、灵敏度高、快速简便的等温核酸扩增技术，近年来在核酸检测领域有着广泛的研究和应用[18]。郭建平等[19]利用LAMP技术建立了基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法，将反应时间缩短至60 min。张萌等[20]以枣转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）为靶序列，建立了real-time环介导等温扩增技术检测枣花蜜源成分的方法，最低检测限为≥1 pg/μL。肖剑等[21]基于环介导等温扩增技术建立了快速检测植物蛋白饮料中大豆成分的方法，并以PCR方法为参比方法，对32种植物蛋白饮料进行检测应用验证，结果表明，该方法特异性强，32种植物除大豆外，其他均未发生扩增，稳定性好，最低检出限为0.1%（以质量分数计），可以为植物蛋白饮料大豆成分掺杂掺假提供参考。

微流控芯片又称芯片实验室，是微型全分析系统的核心，它是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成或基本集成到一块很小的芯片（几平方厘米）上，由微通道形成网络，可以控制流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台[22]。

微流控芯片在食品安全检测领域得到了广泛应用。苑宝龙等[23]设计制作了一种可以用于农药残留现场快速检测的微流控芯片，7 min内即可实现对克百威和乐果的快速检测，最低检出限分别为0.02 mg/L、0.06 mg/L，对克百威加标回收率为95.0%～103.3%，制作的芯片在1个月内的稳定性较好。鞠鹤鹏等[24]建立了一种结合LAMP和微流控技术检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的方法，制成的微流控芯片具有较好的特异性，3种致病菌的检测敏感性均可达到100 cuf/mL，实现了对3种致病菌的快速检测。周新丽等[25]研制了一套用于牛、羊、猪、鸭和鸡源性成分快速检测的离心式微流控芯片系统，每次可同时检测5个样本，每个样本可同时检测5种指标，能够在30 min内实现半定量检测，具有快速、自动、高通量的特点。王卫芳等[26]研究了林蛙油掺假LAMP检测方法、试剂盒以及微流控基因芯片的制备，通过对比林蛙油的多种检测方法，得出以分子生物学为基础的LAMP检测方法具有较高的先进性和简便性，微流控芯片多重检测具有低成本、高通量的优越性，为林蛙油分子生物学检测提供了新的检测手段。