牛冻精技术研究进展

马莉欣，戴雁峰，2

（1.内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021；2.内蒙古福瑞锦牧业有限公司，呼和浩特 010105）

近年来，人工授精（Artificial insemination，AI）、体外受精（In vitro fertilization，IVF）等辅助生殖技术（Assisted reproductive technology，ART）有效地促进了畜牧业的发展，尤其是在大规模、集约化和专业化生产领域。

精液冷冻技术是关键的辅助生殖技术之一，主要是指人工采精后，利用稀释液将原精液等温稀释，进行平衡处理后快速冷冻，并在液氮中长期保存。目前精液冷冻技术采用的模式多为颗粒冷冻精液和细管冷冻精液。随着体外储存和远距离运输技术的显著提升，精液冷冻技术通过遗传资源的跨区域交流改善了群体繁殖［1］。在实际生产过程中，可以将长期冷冻保存的牛冻精复苏后，检查处理精子活力，人工输入发情母牛生殖道内，使其受胎。目前该项技术是最新的人工授精技术，能够长时间保存优质种公牛的精液，不受时间、地域限制，可最大程度地发挥出优质种公牛的繁育能力［2，3］。

但是需要指出的是，在哺乳动物精子冷冻保存、复苏过程中，由于活性氧（Reactive oxygen species，ROS）产生不平衡和氧化应激增强而导致的冷冻损伤严重降低了精子功能和存活率，从而导致精液质量恶化［4］。氧化应激主要由ROS的过度产生或抗氧化能力的降低引起，在冷冻保存过程中会降低精子的活力、线粒体活性以及膜通透性，进而引发的DNA链断裂及Ca2+、K+水平增加导致精子活力下降，使其受精能力显著降低［5-10］。寻找更好的精液冷冻保存系统以提高精液质量和最佳妊娠率一直是研究人员和育种者的长期追求，本文对当前牛精液冷冻技术进行了概述，以期为后续实际生产、应用提供理论依据。

1 牛冻精技术发展及优点

在20世纪50年代，Fraser等［3］首先开展了牛冷冻精液技术，这项技术的提出符合家畜育种的迫切需要，并且是建立在人工授精发展的基础上，作为精液长期保存的解决方案，牛冻精技术的实施使得家畜的繁殖育种和人工授精技术得到了快速的发展，也使得全国养殖场之间的协作能够快速、大规模且有计划的开展。

与此同时，在家畜养殖中，牛冻精技术使得个体饲养户及企业经济效益得到极大的提高，家畜养殖若采用自然交配的方式繁衍后代，1头公牛1年大约只能配种25头左右的母牛。若采用精液低温或常温的保存方式再进行人工授精，1头公牛1年大约能配几百头左右的母牛，而利用冷冻方法保存的精液进行人工授精，1头品种优质的公牛1年能配种几千甚至上万头的母牛。

近年来随着化工技术、生物化学、生理学、物理学等学科的高速发展，使得牛精液在冷冻、保存、运输方面不仅提供了理论以及技术上的支持，还使这项技术得到了快速的发展。目前，牛冻精输精技术可以随时随地开展，摆脱了种牛寿命的限制，使得家畜繁殖育种的工作速度和工作质量都得到了提高。此外，牛冻精技术还具有扩大配种数量、提高优秀种公牛的有效利用、减少种公牛的饲养、防治疾病、提高受胎率、消灭不孕、远距离运输等诸多优点［11］。

2 不同牛冻精技术的优缺点

常规缓慢冷冻（程序化冷冻）和玻璃化冷冻是牛冻精技术的主要方法。作为最常用的技术，程序化冷冻以1~2℃/min的降温速度将精子冷却至-196℃。这种传统冷冻方法的缺点主要是在冷冻过程中细胞内冰晶的异常产生，其次是由于潜热耗散不足导致的细胞机械性损伤；细胞内冰晶会破坏细胞骨架，而细胞外冰晶会增加溶质浓度和渗透压，引发细胞失水，进一步导致精子活力下降。与此同时，程序化冷冻也导致精子复苏后获能不足的现象［11，12］。

玻璃化冷冻法是先在温度较低的环境下把浓度高的冷冻保护剂凝固，这样固体形态变成不太规则的玻璃化形态，能够保存液体分子和离子的正常分布。所以细胞内有玻璃化产生时，玻璃化冷冻能够起到保护细胞的作用。目前牛精子、卵子和胚胎的冷冻保存技术发展迅速，但是并未实际应用到生产中，相关机制正在研究中。根据目前研究结果，玻璃化冷冻优于常规化冷冻，有希望应用至未来的牛精液冻存中。

3 牛精液冻存、复苏过程中的损伤

牛精液冻存、复苏过程中，代谢途径、酶和抗氧化剂活性的改变导致精子质膜结构的破坏，降低了精子寿命和受精能力，主要的损伤诱因有如下几点。

3.1 渗透胁迫

低温保存引发的冷却压力改变精子内的渗透压［13］，最终导致冷冻精液质量下降。精子体积小，表面积大，冻存导致其黏度在玻璃化转变温度中发生转变，促进细胞外冰晶的形成［14］。冰晶的形成增加了精子外溶质浓度（如糖、盐和蛋白质），进而改变了细胞内外渗透压，导致细胞脱水［15］。研究报道指出，冻存中精子的脱水程度与温度下降程度呈负相关［16］，虽然温度下降速率增大，细胞内脱水程度降低，但是温度下降速率过高时，精子内细胞冰晶的产生水平增强，引发了对细胞膜和其他细胞内成分的物理损伤，导致细胞死亡［17］。

3.2 氧化应激

在冷冻保存过程中，线粒体膜流动性和精子膜磷脂结构的变化均会导致精子内ROS的生成，从而引发细胞内的氧化应激，破坏精子内的碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸的结构及功能［18］。

3.3 生物物理和超结构变化

富含多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）的牛精子质膜由于极易发生过氧化，是冷冻保存过程中受损的主要部位［19］。冻存操作引发的异常脂质过氧化、冰晶形成和渗透梯度会导致精子细胞膜的不可逆损伤。冷冻和复苏过程中的温度和渗透效应导致的精子含水量改变使精子暴露于高盐浓度下，该过程产生的机械应力导致了质膜的不对称性。

与此同时，降温过程也会导致精子细胞膜磷脂横向运动受限，引发脂质聚集及蛋白质的不可逆聚集，从而改变细胞膜结构［20］。此外，精子头部质膜结构重组和磷脂运动受限与冷冻导致的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺外化密切相关［21，22］。精子头部质膜的结构重组破坏了公牛精子与雌性生殖道中的卵母细胞正常融合的能力。

此外，降温过程也会导致精子内细胞器的超微结构损伤，使得复苏后的精子容易出现大体形态缺陷、顶体异常、线粒体活性降低、ATP生成减少等问题，而且细胞完整性、活力、运动性和受精能力也大幅度下降［23，24］。

3.4 分子改变

冻存过程中，渗透性和温度的变化导致精子脂质和蛋白质结构的重组，从而降低了精子的受精潜能。与此同时，冻存对细胞的表观遗传因素如DNA甲基化和组蛋白修饰也有显著调控作用，冻存、复苏等操作显著改变了精子的转录组学特征和复杂生理学，也可导致非编码RNA表达模式的改变，进而基于基因转录、蛋白修饰水平引发细胞凋亡。

冷却应力、细胞收缩、氧化应激、渗透压变化和DNA修复酶的异常也可能导致细胞核DNA的不稳定性，在牛精液冷冻中具体表现为染色质松弛、DNA断裂及碎片化，从而导致父系遗传信息的不准确传递，严重时可导致胚胎植入受损及妊娠失败。

3.5 细胞凋亡

冻存可触发精子的凋亡，在人类、猪及牛的冻存精子中可以检测到膜磷脂酰丝氨酸易位，进而引发细胞凋亡，具体表现为线粒体膜电位降低、半胱天冬酶激活、细胞体积减少、DNA断裂和膜通透性增加［25］。

3.6 代谢改变

冻融损伤改变了机体的能量来源和生理功能，精子细胞需要来自稀释液的持续能量供应，并且随着运动能力的增强，这种需求显著增加。营养素在细胞内代谢，通过糖酵解、柠檬酸循环和氧化磷酸化产生富含能量的ATP，但该过程受到各种冷却压力的阻滞，由于糖酵解过程的临界性，冻存后精子内的ATP浓度降低，AMP/ADP转化率增加，损害了精子的基本功能［26，27］。

4 提高牛冻精改良受胎率的关键技术措施

4.1 做好发情鉴定

在牛冻精输精前，应该做好受体的发情鉴定，避免输精后个体妊娠失败。

4.1.1 发情前期发情前期是母牛发情的一个准备阶段。此时期母牛通常会有一点烦躁不安的症状，并且慕雄。这个时期通常持续3~5 d，其中最为明显的表现是在母牛的阴道中会流出较稀且黏的液体，而且阴户也会慢慢变大。

4.1.2 发情高潮发情高潮是母牛的性欲最为强烈的时期，这个时期是母牛整个发情阶段生理变化最为明显的时候，在此时期母牛会有激动、情绪不安、经常发出叫声、食欲不振，最明显的症状是阴道部位有透明类似纤维状的较黏的液体流出，且外阴处有肿胀。这个时期通常持续时间只有12~18 h。

4.1.3 发情末期发情末期时，母牛的各种表现都发生了改变，首先阴道部位透明类似纤维状的较黏的液体分泌量减少，颜色逐渐加深，最后变成乳白色。情绪方面也不再有兴奋不安的状态，逐渐平静，外阴处的肿胀也逐渐消失。

4.1.4 休情期这时母牛的性欲已经消失，这个时期通常持续时间能够达到10~14 d。

4.2 输精判断

4.2.1 准确掌握输精时间授精操作人员可以利用直肠检查法来判断母牛卵泡的发育情况准确掌握输精时间，摸卵泡时能够感受到波动感，卵泡具有脆弱感时即可说明此时卵泡发育状态适合输精。

通常情况下，母牛的发情时间大概是4~18 h，发情之后就是排卵的时间，即在发情后的10~12 h，大概是在发情末期外阴处的肿胀也逐渐消失症状出现之后。对于不同年龄的母牛配种时间也要有所调整。通常情况下，年龄较大身体素质相对较差的母牛发情时间较短，而且排卵的时间相对又早，要尽量把配种时间提前。年轻体壮的母牛发情时间较长，而且排卵时间相对又晚，要尽量把配种时间延后。

4.2.2 准确掌握输精部位由于母牛最适合输精的部位是子宫体，所以通常人工授精时就将精液输入该部位。假如输精的时间相对较晚，可将精液输在具有排卵功能卵巢侧的子宫角内。

4.3 人工授精技术

4.3.1 输精器械及操作人员的准备

4.3.2 发情牛保定与消毒把适合输精的母牛放入配种专用的保定架里，之后再由工作人员将其尾巴用栓尾绳拴住并且系在高处或直接拉住母牛尾巴。此时其他工作人员先用干净的温度适宜的水清洗该母牛外阴部位，再将外阴处消毒，消毒可用酒精棉球轻轻擦洗或使用0.1%的高锰酸钾溶液清洗。

4.3.3 精液细管装枪将解冻后的精液取出，用消过毒的棉布将细管外部的液滴擦掉，再用消过毒的剪刀将封口剪掉，剪刀应距封口顶端1.3 cm左右，之后把具棉塞一端装进输精枪中，注意要平行装入。剪口一端要和输精外套管紧密连接，以防精液回流至输精外套管里面，在此过程中，务必避免任何可能对母牛的生殖道造成污染的操作。

4.3.4 输精输精时通常采用直肠把握输精法，在此过程中，注意避免空气进入直肠引起直肠膨胀，导致受体不适的情况。同时，在输精器接近子宫颈外口时，用把握子宫颈的手向阴道方向牵拉子宫颈，使其接近输精器前端，避免输精器损伤子宫颈。在输精过程中，输精器前进方向、回抽、摆动、滚动等需要灵活掌握，避免受体不适造成输精失败。

输精操作结束后应做好记录，记录要及时、详细，如牛编号、胎次、上次产犊时间、发情时间、配种时间、配种次数、精液用量、配种人员、公牛精液等信息。

5 结语

在广大基层地区积极推广冻精改良技术，是牛养殖产业不断向前发展的重要举措。积极推广牛冻精改良技术，可在短时间内实现优质种公牛精液的快速普及，快速覆盖，提高优质种公牛的利用效率，降低养殖场购买种公牛的经济成本。对于养殖规模较大的养殖场和养殖户，应用该项改良技术具有显著的经济效益，能有效增加繁殖母牛的受胎率，及时发现不健康的种公牛精液，避免繁殖系统疾病的传播蔓延。