冷冻电镜成像中噪声的滤波方法进展

黄新瑞，李 莎，高 嵩△

(1. 北京大学基础医学院生物化学与生物物理学系，北京 100191； 2. 北京大学医学部医学技术研究院，北京 100191)

1 冷冻电镜的发展背景

在人类基因组测定之后，人们发现仅从基因组序列的角度无法完整、系统地阐明生物体的功能，因此，研究以蛋白质为主体的生物大分子三维结构和功能之间的关系成为现代生命科学的一个重要研究领域，尤其是生物大分子高分辨率三维结构的研究甚至原子水平结构的研究[1-2]。透射电镜本质上有原子尺度分辨率的能力，但由于生物样品易受辐照损伤、图像衬度差、信噪比低的特点，使其对生物大分子的高分辨率结构解析比较困难[3-4]。冷冻电镜(cryo-electron microscopy)成像采用冷冻电子显微技术和计算机三维重构技术相结合的方式[5-6]，将含水生物大分子快速冷冻(>104℃/s)到液氮或液氦温度，并在低温条件下(～100 K)采用低电子剂量(如5～10 electron/A2)成像，从而在高分辨水平上研究生物大分子的三维结构。由于生物大分子样品被冷冻的速度极快，样品内部的水来不及结晶而形成玻璃态的冰，从而避免了晶态冰形成时破坏生物分子样品的结构[7-8]。这层非晶态的冰一方面可在电子显微镜中支撑样品，另一方面也可以在电子显微镜镜筒的高真空环境中很好地保存含水生物大分子样品中的水，从而更好地保护生物大分子样品，让其处于或接近于其生理活性状态，有效提高了分辨率[9-10]。冷冻电镜研究的对象小至几个纳米大小的单个蛋白质分子，大至整个病毒粒子，甚至是微米尺度的细胞器[11]。

冷冻电镜技术在生物领域目前主要有三大研究手段：电子晶体学、单颗粒分析、电子断层三维重构技术。电子晶体学方法是将生物分子的二维晶体在电子显微镜中进行倾斜来收集不同方向的衍射谱，再将这些衍射谱在傅里叶(Fourier)空间进行整合来解析生物大分子的结构[12]。单颗粒方法是对多个取向不同的结构完全相同的生物分子或复合体进行分类、叠加平均和三维重构来解析它们的结构[13]。电子晶体学和单颗粒分析均要求纯化的生物样品具有较好的均一性，但对没有结构同一性的生物样品(如细胞、病毒或生物组织等)只能采用电子断层成像方法，通过获取同一区域的多个角度的投影图来反向重构它们的三维结构。经过近40年发展，尤其是近5年的技术突破，冷冻电镜技术特别是单颗粒技术，因其在生命科学领域的突出应用价值和前景，三位发展冷冻电镜技术的先驱科学家分享了2017年的诺贝尔化学奖[5,14-16]。虽然冷冻电镜技术取得了突破，但由于一些瓶颈问题的存在，单颗粒技术的分辨率有待进一步提高，亚纳米原位结构解析的电子断层重构技术有待进一步发展和建立。冷冻电镜中电子束辐照损伤仍是提高三维重构分辨率的关键限制因素[17-19]。在冷冻电镜成像中，由于样品未经染色而图像衬度很低，样品对辐射损伤的耐受能力虽因冷冻而增加，但为获得高分辨图像，在观察和拍照时所用的电子剂量必须很小，因此，与常规电子显微镜方法相比，冷冻电镜方法的信噪比低(如电子断层成像中信噪比通常小于0.1)。这就是说，冷冻电镜方法虽然能够很好地保存生物大分子天然状态的结构，但这些结构细节被淹没在噪声之中而难以辨认。低对比度、低信噪比和高噪声对图像识别、对齐、重构及结构的显示与解释都有极大影响。当前用于生物大分子三维重构的硬件(如电子显微镜和计算机等)都已发展到非常高的水平，而三维重构的理论和相应的图像处理技术发展却相对滞后，尤其是针对冷冻电子断层成像(cryo-electron tomography)的图像处理和重构技术[6]。

本文总结了冷冻电镜领域多位学者对于冷冻电镜图像特点和相应成像技术的研究工作，提出使用各种滤波器进行噪声抑制问题，以期在被噪声“污染”的数据中找出有价值的信息，提高图像信噪比，获取高分辨三维结构，得到最好的显示效果用于解释生物大分子的三维结构和功能。

2 冷冻电镜成像中的噪声模型

冷冻电镜图像在生成和传输过程中常常因受到各种噪声的干扰和影响，如环境因素、设备因素等[20]，使得图像模糊，甚至淹没图像特征，妨碍对所接受的图像源信息进行记录、理解或分析，这对后续图像的处理和生物分子结构的正确获得和解释都将产生不利影响[21]。虽然近年来具有先进电子光学系统的高稳定电子显微镜(如FEI Titan Krios)和直接电子探测器(direct detection device)得以研制开发和成熟应用，使得硬件设施具有优异性能，但冷冻电镜成像中仍不可避免多种噪声干扰，根据不同分类准则可将噪声分类如下：(1)按照产生原因，图像噪声可分为外部噪声和内部噪声。外部噪声指系统外部干扰以电磁波或经电源耦合进系统内部而引起的噪声，如外部电气设备产生的电磁波干扰、天体放电产生的脉冲干扰等。由系统电气设备内部引起的噪声为内部噪声，如内部电路的相互干扰。内部噪声一般又可分为以下四种：(a)由光和电的基本性质所引起的噪声，如由光的统计本质和图像传感器中光电转换过程引起的光电子噪声；(b)电器的机械运动产生的噪声；(c)器材材料本身引起的噪声，例如在阻性器件中，由于电子随机热运动而造成的电子噪声；(d)系统内部设备电路引起的噪声。(2)按照统计特性，图像噪声可分为平稳噪声和非平稳噪声，统计特性不随时间变化的噪声称为平稳噪声，统计特性随时间变化的噪声称为非平稳噪声，即此种噪声在图像中的分布和大小不规则，具有随机性。(3)按照噪声的概率分布情况，图像噪声可分为高斯(Gaussian)噪声、泊松(Poisson)噪声、瑞利(Rayleigh)噪声、伽马(Gamma)噪声、指数噪声和均匀噪声等。根据噪声幅度随时间的分布形状，若其幅度分布遵循高斯分布就称其为高斯噪声，遵循泊松分布就称其为泊松噪声，遵循瑞利分布就称其为瑞利噪声。根据噪声频谱形状，若其频谱均匀分布就称其为白噪声，若其频谱与频率成反比就称其为1/f噪声，若其频谱与频率的平方成正比就称其为三角噪声等。(4)按照噪声和信号之间的关系，图像噪声可分为加性噪声和乘性噪声，例如在串联图像传输系统中，若各部分串入噪声是同类噪声可以进行功率相加，依次信噪比下降。假定信号为S(t)，噪声为ε(t)，如果混合叠加波形是S(t)+ε(t)的形式，则称其为加性噪声。加性噪声和图像信号强度是不相关的，如图像在传输过程中引进的“信道噪声”。如果叠加波形为S(t)[1+ε(t)]的形式，则称其为乘性噪声。乘性噪声则与信号强度有关，往往随图像信号的变化而变化，例如胶片图像颗粒噪声。噪声与图像之间一般具有相关性，例如摄像机的信号和噪声相关，黑暗部分噪声大，明亮部分噪声小；又如数字图像中的量化噪声与图像相位相关，图像内容接近平坦时，量化噪声呈现伪轮廓，但图像中的随机噪声会因为颤噪效应反而使量化噪声变得不很明显。为了分析处理方便，往往将乘性噪声近似认为是加性噪声，而且总是假定信号和噪声是互相独立的，因而噪声具有叠加性。

冷冻电镜成像中影响图像采集的环境因素(如磁场变化、机械和声振动、房间热不稳定性和电磁镜片等)大的波动都被不同的物理装置(实时磁场，例如补救补偿器、隔音器、空调和水冷系统)进行最大程度的消除，所以一般认为剩余相关噪声的效果围绕平均值居中，是加性的并遵循高斯分布。来自传感器[如电荷耦合器件(charge coupled device, CCD)或直接电子探测器相机(electron direct detection device, DDD)]的非常低的噪声大致为泊松噪声，来自非弹性电子束与样品相互作用的噪声是高斯分布。基于以上冷冻电镜成像中的噪声特点，目前一般认为冷冻电镜图像噪声为零均值加性高斯白噪声图像模型[22-23]，即：f(n)=I(n)+ε(n)，其中f(n)为冷冻电镜图像数据，n∈{1, 2, …, N}代表具有N个像素的图像f中的每一个像素指标，I(n)为理想的无噪声图像，ε(n)为零均值加性高斯白噪声，即ε:Norm(0,σ2)，其中σ2为图像f的噪声方差。

由于高斯噪声在空间和频域中数学上的易处理性，这种噪声(也称为正态噪声)模型经常被用于冷冻电镜图像的建模分析中。由于噪声对冷冻电镜图像的生成、采集、处理等各种环节以及输出结果的全过程都有影响，为了抑制噪声，改善图像质量，便于更高层次的处理，去噪已经成为冷冻电镜图像处理中极其重要的一个步骤。图像去噪本质就是在尽量保持原有图像数据的前提下将噪声数据剔除[24-25]，即通过记录的噪声图像数据f最大限度估计理想无噪声图像数据I，即得到去噪后的图像数据fdenoised。

3 冷冻电镜中常用滤波器的应用分析

图像处理领域中常见的去噪方法大致有以下四类：(1)基于图像的空间域或变换域进行滤波去噪；(2)基于偏微分方程进行图像去噪；(3)利用数学变分法的思想进行图像去噪，如全变分(total variation, TV)模型；(4)利用形态学噪声滤除器进行图像去噪。前两类目前在冷冻电镜图像处理中已有广泛应用实例，空间域滤波是在原图像上对像素的灰度值直接进行处理，冷冻电镜领域常见的空间域图像去噪算法有均值滤波、中值滤波、高斯低通滤波等；图像变换域去噪方法是对图像进行某种变换，将图像从空间域转换到变换域，再对变换域中的变换系数进行处理，然后再进行反变换将图像从变换域转换到空间域来达到去除图像噪声的目的。将图像从空间域转换到变换域的变换方法很多，如傅里叶变换、小波变换、余弦变换、沃尔什-哈达玛变换(Walsh-Hadmard transform)以及K-L变换等。傅里叶变换和小波变换是常见的用于冷冻电镜图像去噪的变换方法[26-28]。实际应用中，结合冷冻电镜三维重构流程，对冷冻电镜图像滤波处理的图像数据类型主要为两类：对投影数据去噪处理和对重建图像去噪处理[29-32]。任何滤波器都有一定的优点和缺点，滤波器的性能完全取决于应用场合[33]。

冷冻电镜单颗粒三维重构算法首先需要挑选大量的二维投影样本，然后利用一定的三维重构技术，重构出其三维空间结构。随着重构精度逐渐要求达到原子级水平，待挑选的蛋白质颗粒也达到了上万甚至上百万的水平，从高噪声冷冻电镜图像中识别生物大分子颗粒、校正、对齐等，直接影响三维重构的效率和精度[34-37]。一般的图像处理步骤为[38]：(1)对使用直接电子探测器以电影模式(movie mode)一秒钟之内获得的至少几十张投影图片进行样品漂移修正[39-40]；(2)对投影图像进行图像质量评估并挑选；(3)对挑选的投影图像进行衬度传递函数(contrast transfer function, CTF)的校正；(4)挑选单颗粒样品的投影；(5)单颗粒样品二维投影数据的对齐、分类和筛选[41]；(6)单颗粒三维模型的重构和优化；(7)三维模型分类及多重构象的结构分析；(8)评估重构的三维模型的分辨率；(9)三维重建结构的显示及解释。目前常用的重构软件包括Spider、EMAN、XMIPP、Relion等[42]，考虑到高噪声对获取最后高分辨率三维结构的影响，这些软件里面均植入了基本的通用滤波器，如高斯滤波器或均值滤波器等。为了进一步提高图像处理效果，研究人员也针对冷冻电镜图像开发了一些专门的滤波程序，如EMAN软件中的双边滤波器[43]、ImageMagick软件中的歧视性双边滤波器、Bsoft软件中的迭代中值滤波器、FREALIGN软件中的维纳(Wiener)滤波器等。

冷冻电子断层成像是将冷冻样品沿固定旋转轴旋转、倾斜不同角度拍照(例如在-60°～60°的范围内，将样品每倾斜2°拍一张照片)，即可获得该样品的一组投影，一般称之为“倾斜系列(tilt series)”[44]。在此基础上，利用专门的图像处理软件计算出样品的三维结构(cryo-tomogram)，研究其任一断面的结构或整个断层体积中内容物的结构。由于冷冻生物样品受辐射总剂量限制(约不超过100 electron/A2)，在保证样品不损伤且能最大限度获取投影图片的情况下，每张图片的剂量会极低(约1～2 electron/A2)，导致噪声往往会非常高。尤其对于生物组织这样的厚样品在大倾转角数据收集时，增加了非弹性散射和多重散射电子的比例，降低了有用的弹性散射电子在图像形成中所占的比例，结果投影图像的信噪比更低[45]。受冷冻电子断层成像有限倾斜角和高噪声的限制，现有的三维重构算法(如常用的加权背投影算法和同时迭代技术)在数据缺失和高噪声条件下不能获得较好的重构效果，使得重构后的三维结构也淹没在大量噪声中。一般的图像处理步骤为：(1)高通量自动化低剂量倾转序列图像数据收集，对快速冷冻或高压冷冻的样品使用较低放大倍数，找到合适的成像区域后，在成像区域附近聚焦，对成像区域低剂量曝光拍照，然后将样品倾转到下一个角度对同一成像区域精确跟踪后再次拍照，从而完成整套数据收集；(2)倾转序列图像对齐配准；(3)电子断层图像的三维重构；(4)对重构的三维断层体数据的分割和结构理解[46]。目前也有专门的软件来完成这一重构流程，如SerialEM、UCSFTomo、Protomo、TOM、Xplore3D、IMOD、Chimera、Amira等。由于冷冻电镜收集的各角度图像所用的电子剂量很低，故数据信噪比很差，重构后产生的三维图像的噪音同样很大。无论是在数据收集或图像对齐过程中对目标区域的识别跟踪，还是在重构后对三维体数据的显示或分割，降噪处理变得很有必要[47-48]。目前，冷冻电子断层成像常用的降噪处理主要包括区域合并(binning)和滤波处理，而滤波的常用方法包括带通滤波、中值滤波、非线性滤波等，其中各项异性扩散的非线性滤波方法效果最为出色，已被植入常用重构软件IMOD中。

虽然冷冻电子断层重构的结构本身不具有结构全同性，但是它的一些亚单元结构(如包膜蛋白结构)可能会有一致性，可对这些结构均一的目标对象分割提取进行量化表征。如果目标对象在样品中结构一致，且数量较多，可以将其分离出来，并做进一步的分类和密度平均，提高研究对象的分辨率，获得其更加精细的结构，从而清楚、直观地获得目标对象在整个重构区域中的三维分布，即为亚单元平均技术(subvolume averaging)[49-50]。目前此技术面临的关键问题是冷冻电子断层重复亚单元的提取、识别和对齐分类等，由于冷冻电子断层图像的低对比度和低信噪比等特点，很难达到理想的效果。一般需先对重构后的断层图像降噪处理，在较好的衬度和分辨率范围下判定生物学对象是否含有有价值的信息。重复亚单元的颗粒识别分类是冷冻电镜亚单元平均三维重构方法非常重要的环节，直接影响亚单元三维重构的效率和三维结构的精度。从低对比度和低信噪比的冷冻电镜图像中提取成千上万个生物颗粒是一件相当耗时的工作，已经成为三维重构过程的瓶颈，自动颗粒识别方法的研究已成为当前关注的焦点，数据噪声是影响自动颗粒识别的关键因素。

以下将针对上述冷冻电镜成像中不同成像手段及其不同图像数据处理流程中常用的滤波器的优缺点具体分析，以期为进一步发展新的有效滤波算法奠定基础。

3.1 高斯滤波器

高斯滤波器是一类根据高斯函数的形状来选择权值的线性平滑滤波器，对于抑制服从正态分布的噪声非常有效。高斯滤波是一种各向同性的加权平均滤波，离目标像素越近的点对最终结果的贡献越大，反之则越小，即每个邻域像素点权值是随该点离目标像素点的距离单调增减的。这一性质是很重要的，因为边缘是一种图像局部特征，如果平滑运算对离算子中心很远的像素点仍然有很大作用，则平滑运算会使图像失真。高斯滤波后图像被平滑的程度取决于标准差σ。σ越大，高斯滤波器的频带就越宽，平滑程度就越好。通过调节平滑程度参数σ，可在图像特征过分模糊(过平滑)与平滑图像中由于噪声和细纹理所引起的过多的不希望突变量(欠平滑)之间取得折中。在冷冻电镜图像处理中，高斯平滑滤波器无论在空间域还是在频率域都是十分有效的低通滤波器，且在实际图像处理中得到了有效的使用，尤其是单颗粒分析技术中，在颗粒挑选前被广泛采用以便对颗粒进行识别[51-52]。

3.2 中值滤波器

中值滤波器是一种比较经典的非线性滤波方法，是基于排序统计理论的一种能有效抑制噪声的信号平滑处理技术。中值滤波的基本原理是把图像数据中目标像素点的值用该点的一个邻域中各像素点值的中值代替，从而消除孤立的噪声点。方法是用某种结构的滑动模板，如通常选3×3正方形区域二维模板或3×3×3立方体区域三维模板为待滤波二维或三维数据中目标像素点的邻域，按照像素值的大小将模板内像素点排序，生成单调上升(或下降)的二维或三维数据序列，从而确定模板内像素点的中值代替目标像素的值，通过模板在待滤波数据空间的移动完成整个滤波过程。相对于古典线性平滑滤波器(如高斯低通滤波器)，中值滤波器的优点是倾向于保护图像边缘信息，同时检测去除脉冲噪声给图像处理带来的影响。中值滤波器的缺点是受滑动模板尺寸的限制：模板小，不能有效地消除噪声；模板大，会破坏图像的有用细节。目前有研究者改进传统中值滤波为迭代中值滤波，对冷冻电镜图像自动去噪，以期在适度内存要求下实现对冷冻电子断层重建结构图进行快速分割、体征提取和模式识别[53]。

3.3 维纳滤波器

维纳滤波器是数学家Norbert Wiener在20世纪40年代提出的一种频域滤波器，它较好地解决了一般频域滤波器直接滤除图像的高频分量，使得图像的细节信息随着噪声信息的去除而一起丢失的问题。维纳滤波器对图像的高频分量进行适当衰减，而非简单舍弃，有较好的去噪性能。维纳滤波基于最小均方误差准则，滤波器的输出与期望输出之间的均方误差为最小，是对平稳过程的最优估计，可用于提取被平稳噪声所污染的信号。例如，对于运动引起的图像模糊，最简单的方法是直接做逆滤波，但是逆滤波对加性噪声特别敏感，使得恢复的图像几乎不可用，而维纳滤波的目标是找到未被模糊图像的一个估计，使它们之间的均方差最小，可以去除噪声的同时清晰化模糊图像。维纳滤波器已经应用于二维和三维冷冻电镜图像的数据处理，目标是将嘈杂的图像用无噪声对象组合成最佳表示，因为维纳滤波器可通过获得估计的傅里叶空间表示的信噪比数据，即频谱信噪比(signal-to-noise ration，SSNR)，来抑制噪声傅里叶空间测量不足部分，以获得更好的符合无噪声信号的效果。研究发现，冷冻电镜单颗粒分析三维重构中的三维颗粒的SSNR映射与颗粒占据的分数体积成线性比例，使用SSNR和傅里叶壳层相关(Fourier shell correlation,FSC)功能评估可减轻重构中噪声产生的误差[54]。而通常计算SSNR和FSC在颗粒周围的溶剂区域中包含噪声，因此不能准确反映颗粒密度本身的信号。FREALIGN 8.10整合的“单颗粒维纳滤波器”在粒子体积已知情况下可以最小化重构粒子的误差映射，适用于广泛的现有3D重建技术，特别适用于傅里叶反演方法的有效和准确实施[55]。

3.4 双边滤波器

双边滤波器是一种局部加权平均策略的滤波方法，它考虑了像素点间的空间邻近度和灰度相似度，在图像变化平缓的区域，目标像素点邻域内像素灰度值相差不大，双边滤波转化为高斯低通滤波器；在图像变化剧烈的区域，滤波器利用边缘点附近灰度值相近的像素点的灰度平均值替代原灰度值。双边滤波同时考虑空域信息和灰度相似性，达到保边去噪的目的。一般的维纳滤波或者高斯滤波降噪，都会较明显地模糊边缘，对于高频细节的保护效果并不明显。高斯滤波在低通滤波算法中有不错的表现，但只考虑了像素间的空间位置关系，并没有考虑像素值之间的相似程度，因此得到的滤波结果通常是整张图片一团模糊。尽管双边滤波具有一定保护图像边缘的优势，但其对边缘有一定挑剔性，会限制其在降噪中的应用。例如，低剂量冷冻电镜图片中，脉冲噪声造成的稀疏分布的高频噪声像素，就不会有效地被双边滤波器去除，因而有研究者开发了歧视性双边滤波器[56]，已被证明在单颗粒分析方面有助于单颗粒识别框选、分类、对齐和三维图像重建，在断层图像中有助于自动图像分割。另外，结合边缘检测算法，有研究者开发了双边边缘滤波器[57]，与传统边缘检测技术(如递归和Canny算法等)相比，双边边缘滤波器需选择和调节的参数较少或无需参数输入，非常适合追踪随机取向的单颗粒，而且可对跨多个尺度的复杂细胞结构进行有效分割以用于进一步的下游处理，例如细胞注释和断层扫描亚单元平均，为准确和高通量识别亚单元提供了有价值的工具，在亚细胞层面的三维结构复杂性注释，以及映射空间和时间到细胞层析图中原位重组大分子结构的应用中发挥重要作用。

3.5 非局部均值滤波器

均值滤波器是一种线性平滑滤波器，它是给图像上的目标像素一个模板(如3×3模板，以目标像素为中心的周围8个像素，构成一个滤波模板)，再用模板中的全体像素的平均值来代替目标像素原来值。均值滤波器的主要应用是去除图像中的不相关细节，其中“不相关”是指与滤波器模板尺寸相比较小的像素区域。然而，由于图像的边缘也是由图像灰度的尖锐变化带来的特性，所以均值滤波处理还是存在着边缘模糊的负面效应，对脉冲噪声消除效果也不理想。均值滤波算法中，目标点上的像素值由其所在位置上周围的一个小局部邻近像素值所决定。这种局部平滑方法虽然可去除噪声并保持图像基本的几何架构，但是无法很好地保留一些精细的结构、细节以及纹理。1999年，有研究使用非局部自相似性来合成纹理、填补图像中的小洞，发展了非局部化(non-local means)的图像去噪算法，该算法扫描图像的很大一部分来寻找与目标像素点相似的所有像素，通过所有相似像素的平均灰度来实现滤波。目前多名研究者已经证明，非局部均值滤波器是冷冻电镜图像数据处理和分析的有用工具，其中包括优化的局部自适应非局部均值滤波器、基于Zernike矩的非局部均值滤波器等，可在保存信号细节的同时显著抑制噪声[58-59]。

3.6 各向异性扩散滤波器

非线性各向异性扩散(nonlinear anisotropic diffusion，NAD)滤波器是一种非线性的滤波方法，是用方向性分布系数函数来代替线性热传导方程中的常系数后形成的，其目的是为了克服线性滤波方法存在模糊边缘和移动边缘位置的缺点。NAD滤波的基本思想是，在可能是边缘的地方减小扩散系数，从而在边缘处扩散减小(甚至为零)来保护边缘，而在均匀区域扩散增大来消除噪声，由于其平滑度依赖于图像的局部特征，所以它会受图像均匀度的影响。

NAD滤波器是通过研究高斯滤波与偏微分方程之间关系发展的基于偏微分方程的去噪算法[60]。偏微分方程具有各向异性的特点，所以在图像去噪中，可以在去除噪声的同时，很好地保持边缘。偏微分方程方法所利用的先验信息是图像为分片光滑的二元函数，只是该函数在某些重要数据处不连续。根据图像分片光滑的特性可构造关于梯度的约束，而根据图像处理目的不同又可构造图像与原始图像之间的相似性约束，将此两个组合即得到变分方程，进而由欧拉(Euler)方程得到图像处理的抛物方程。此滤波器成立的统计学基础可以用尺度空间理论来解释，已用于体积重建断层扫描的去噪。目前用于局部增强的NAD滤波器主要基于边缘增强扩散和相干增强扩散。Frangakis等[61]在2001年将该方法应用于电子显微镜的示例表明它非常适合二维倾斜角度投影图像去噪，可减少多重散射事件和量子分解效应导致的噪声，通过提高单个角度投影图像质量从而提高三维重构的体积质量。

基于偏微分方程的NAD滤波主要是通过随时间变化的更新迭代，使得图像向所要得到的效果逐渐靠近。该方法在确定扩散系数时有很大的选择空间，在前向扩散的同时具有后向扩散的功能，所以具有平滑图像和将边缘尖锐化的能力。偏微分方程在低噪声图像的处理中取得了较好的效果，但是在处理高噪声图像时去噪效果不理想，而且处理时间较长。该算法的一个关键问题是什么时候停止过滤过程(即最佳迭代次数设定)，使得信号信息不是错误分类或模糊。虽然目前提出了几个客观停止标准，但大多数不适用于低温电子断层扫描数据，一般都需用户手动选择，产生的结果将依赖于对该特定图像的主观判断。

3.7 小波滤波器

前述滤波器在实际运用到低剂量高噪声的冷冻电镜图像中时，通常会造成图像灰度级损失，图像清晰度下降。因为被处理的图像某一具体区域与空间域中对应部分并非简单的一一映射关系，对被处理域图像的滤波，哪怕仅仅是一个数值的修改，就会导致原图像中的相关区域，甚至整幅图像的改变，而且，在被处理域图像各部分、各像素间通常几乎不存在空间域中的相关性，找到一个合适的滤波标准存在一定的难度。传统的去噪方法仅适用于信号和噪声的频带没有重叠或少部分重叠的情况，当信号和噪声频带重叠较大时，这种方法就无能为力了。小波变换目前已成为国内外应用最广泛且非常有效的医学图像去噪方法，其处理的信号和噪声谱可以任意重叠[62-64]。小波去噪方法的核心是多分辨率分析，通常大尺度对应图像的概貌，小尺度对应图像的细节特征，能在有效滤除噪声的同时，较好地保留图像的细节，被形象地喻为“数学显微镜”而广泛使用于各个图像领域。但是，小波滤波器的组成及求解涉及很多参数选取，针对不同的目标图像，这些参数可能不是普遍适用的，尤其是冷冻电镜成像中，由于生物样品内部结构差异较大，对图像的清晰度和处理速度要求又很高，所以这些小波图像去噪方法在实际的应用中要视目标图像而定[65-66]。本研究组在系统研究冷冻电镜不同成像方法噪声特性基础上，将不同阈值函数、阈值选取方法、小波基等进行了优化组合，构成合适小波滤波器对数据进行滤波处理，结合冷冻电镜成像原理和三维重构方法探索出了有利于获取高分辨率三维结构的小波滤波器及其最优参数，增加了三维数据的信噪比，在去除噪声的同时保持了图像分辨率，三维结构的显示稳定性和质量均有提高[67-68](图1)。

4 展望

冷冻电镜结合三维重构方法发展迅速，成为结构生物学中一个越来越重要并正在取得重要突破的技术，成为解析大型蛋白质复合体、病毒乃至细胞器的三维纳米及亚纳米分辨率结构的有力工具。冷冻电镜图像数据快速、自动去噪算法的开发是针对精准图像分割、特征提取、模式识别的数据分析和图像处理的主要焦点研究内容。冷冻电镜单颗粒技术，通过去噪提高图像质量可为生物分子颗粒高通量自动识别挑选提供有利保证，在图像三维重构不损失分辨率的情况下有效地进行颗粒分类、对齐、校正。冷冻电子断层成像可对图像重构前后的数据分别进行滤波去噪处理，对其三维结构的显示和正确解释提供有力帮助。