白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼(Nibea albiflora)性腺发育的影响*

杨 磊 胡伟华 俞燕洁 陈睿毅 徐冬冬①

白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼()性腺发育的影响*

杨 磊1, 2, 3胡伟华2, 3俞燕洁1, 2, 3陈睿毅2, 3徐冬冬2, 3①

(1. 浙江海洋大学水产学院 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水产研究所 舟山 316021; 3. 浙江省海水增养殖重点实验室 舟山 316021)

黄姑鱼()的性成熟周期短, 养殖技术成熟, 是合适的生殖细胞移植受体。不育受体的制备在鱼类生殖细胞移植中非常关键。为了优化不育黄姑鱼的制备方法, 采用白消安和白消安-高温(30 °C)对黄姑鱼进行处理, 设置5个组: 对照组(Con组)、白消安10 mg/kg组(Bu10组)、白消安40 mg/kg组(Bu40组)、白消安10 mg/kg高温组(Bu10H组)、白消安40 mg/kg高温组(Bu40H组), 白消安以不同剂量进行2次的腹腔注射, 间隔两周。采用组织学、qPCR以及原位杂交等方法分析白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼性腺及其生殖细胞和体细胞发育的影响。研究结果表明白消安处理对黄姑鱼生殖细胞的影响具有明显的性别差异: 雄鱼在处理28 d后其性腺重和GSI较对照组显著下降, 进一步组织学观察发现雄鱼精巢在处理14 d时已经出现空腔, qPCR分析发现雄鱼基因表达在处理期间显著降低, 且在处理第48 d仍处于下调状态。然而, 白消安及其与高温联合处理并未对雌鱼生殖细胞产生明显的影响。研究还发现高温处理组出现较高的死亡率, 但雄鱼生殖细胞的消除效果并未显著增强。因此, 白消安处理能够消除黄姑鱼雄鱼性腺内的生殖细胞, 以40 mg/kg白消安2次(间隔两周)注射后消除效果最好, 能够作为生殖细胞移植受体鱼。

黄姑鱼(); 白消安; 生殖细胞移植;; 原位杂交

鱼类生殖细胞移植是将供体(donor)的生殖细胞移植到同种或异种受体(recipient)中, 利用受体生产供体的配子, 繁育供体的后代, 也被形象地称为“借腹生子”或代孕亲鱼(surrogate broodstock)技术, 该技术在缩短鱼类的性成熟周期、性控育种、濒危物种保护和基因资源保存等方面具有巨大的应用前景(Yoshizaki,2018)。因此, 鱼类生殖细胞移植研究受到学者的高度重视。一般而言, 生殖细胞移植主要包括: (1) 供体细胞的制备, (2) 受体的选择与制备, (3) 供体细胞注射到受体体内培育至性成熟。经过十多年的发展, 鱼类生殖细胞移植取得了一系列的进展: (1) 先后利用胚胎、仔鱼和成鱼作为受体, 建立了生殖细胞移植技术(Ciruna,2002; Takeuchi,2003,2004; Okutsu,2006); (2) 发现了鱼类性腺的精原或卵原干细胞, 从而拓宽了供体移植细胞的来源(Takeuchi,2003); (3) 研发了多种方法制备受体, 其制备方法逐步完善。目前在多种海淡水鱼类中开展了生殖细胞移植的研究, 但成熟的移植体系报道较少, 究其原因, 主要受限于移植受体的制备。

在生殖细胞移植中, 由于受体自身的生殖细胞与供体的生殖细胞存在着竞争关系, 制备不育受体成为生殖细胞移植的关键。目前, 研究学者通过三倍体诱导(Yoshikawa,2017)、人工杂交(Xu, 2019; Kawamura, 2020)、高温-化学药物处理(de Siqueira-Silva,2015; Majhi,2017)以及基因敲除或敲降(Yoshizaki,2016; Yoshikawa, 2020)等方法制备不育受体。其中, 以白消安或白消安和高温联合处理的方法, 能够使鱼类的生殖细胞凋亡。该方法简便易行, 是制备不育受体的可行性途径。在罗非鱼()、银汉鱼()、斑马鱼()等鱼类中, 已经证实白消安或白消安-高温处理的方法能够消除其生殖细胞, 制备生殖细胞移植的不育受体(Majhi,2009a; Lacerda,2010; Nóbrega,2010)。虽然白消安处理可以使生殖细胞凋亡, 但不同种类的处理浓度、方式及时间区别很大, 诱导效果也有较大差异(de Siqueira-Silva,2015)。因此, 对于不同的鱼种, 有必要通过优化处理时间、温度和白消安的剂量等, 研制高温-联合化学药物的处理方法制备生殖细胞移植的受体。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本试验于2019年10—11月在浙江省海洋水产研究所试验基地(西轩渔业科技岛, 舟山)实施。实验鱼选取150日龄(dph, day post hatching)黄姑鱼[全长: (16.13±0.95) cm; 体重: (45.77±8.79) g], 在实验开始前先逐步升温使各桶到达预定温度。

1.2 实验方法

将实验鱼随机挑选到10个玻璃缸桶中(500 L,=50尾/桶), 分成5组, 每组两个平行: 对照组(Con组), 白消安处理组1 (注射浓度: 10 mg/kg, Bu10组), 白消安-高温处理组1 (注射浓度: 10 mg/kg; 处理温度: 30 °C, Bu10H组), 白消安处理组2 (注射浓度: 40 mg/kg, Bu40组), 白消安-高温处理组2 (注射浓度: 40 mg/kg; 处理温度: 30 °C, Bu40H组)。温度处理组用温控仪控制水温, 实验开始前以2 °C/d的幅度升温至30 °C并稳定一周, 实验期间每日上午和下午投喂商品饲料各一次, 吸底换水一次, 记录每日死亡数并将死鱼捞出。

实验开始前测量实验鱼的全长、体长和体重。在实验开始第1天、第14天分别按照剂量腹腔注射白消安, 对照组注射生理盐水, 在第1天、第14天、第28天、第38天和第48天测量生长参数并称量性腺重量, 取样采用4%多聚甲醛（PFA）固定用于组织切片和原位杂交, RNA样品保存于RNA保护液于4 °C过夜后置于–80 °C冰箱保存。

1.3 组织切片学观察

性腺组织取样后以PFA固定, 24 h后逐步更换30%、50%、75%、90%、100%的甲醇, 最终浸泡在100%甲醇中置于–20 °C冰箱保存备用。将样品取出经透明浸蜡后包埋于石蜡中, 以5 μm厚度切片, 用苏木精-伊红染色, 最后用光学显微镜观察, 拍照。

1.4 基因表达分析

性腺组织按照总RNA提取试剂盒(Solarbio, 总RNA提取试剂盒)操作方法提取总RNA, 用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA, 以为内参基因, 基因序列如表1所示, 按照TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒说明书要求进行荧光定量PCR实验。最后用Spss19.0软件分析各基因表达差异性。

表1 用于荧光定量PCR分析的基因及其引物序列

Tab.1 Genes for qRT-PCR and their primer sequences

1.5 原位杂交

将固定在PFA中的样品取出, 经透明、浸蜡后包埋于石蜡中。随后以二甲苯脱蜡, 用梯度酒精水化后依次添加PBST、蛋白酶K、TEA、PBST、PFA、PBST, 再用HYB杂交液预杂交, 随后在HYB杂交液中加入探针(探针序列如表2所示), 60 °C杂交过夜。杂交过夜后用梯度SSC洗脱探针, blocking buffer室温封闭后加入抗体Fab-AP孵育过夜。孵育过夜后用MABT、PBST、AP buffer洗脱并用NBT/BCIP避光显色, 显色后用PBST终止反应, PFA固定后中性红复染。复染后用梯度酒精和二甲苯洗脱染料并封片观察。

表2 用于原位杂交的基因及其探针序列

1.6 数据分析

性腺成熟指数GSI按照公式GSI=(性腺重)/(体重)Í100%计算, 并进行反正弦平方根转换后比较; 用单因素方差分析及多重比较分析各组体重、性腺重的差异性(<0.05)。

2 结果

2.1 生长指标和性腺成熟指数GSI

实验期间, 各处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雄鱼的体重较对照组相比无显著性差异(>0.05, 图1a), 而处理组(Bu40组及Bu40H组)雄鱼的性腺重和GSI在处理第28天时较对照组显著下降(<0.05), Bu10组雄鱼的性腺重和GSI也低于对照组, 但差异不显著(>0.05, 图1b, 1c); 在处理第18天、第38天、第48天时处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雄鱼的性腺重和GSI与对照组相比无显著性差异(>0.05, 图1b, 1c)。各处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雌鱼的体重、性腺重和GSI与对照组相比没有显著性差异(>0.05, 图1d, 1e, 1f)。Con组、Bu10组、Bu40组在实验期间无死亡现象, 而白消安-高温处理组Bu10H组和Bu40H组出现不同程度死亡, 存活率分别为11.4%±0.3%、41.8%±13.0% (图2)。

2.2 组织学观察

组织学观察发现处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雄鱼性腺内的生殖细胞出现不同程度的凋亡(图3)。在处理第14天、第28天时, 对照组雄鱼的精巢内充满精子(图3a, 3e); 相比之下, Bu10组、Bu40和Bu40H组雄鱼的精小叶内均出现空腔(图3b, 3f)。Bu40和Bu40H组雄鱼的精小叶内的空腔面积较大, 只剩下少量精原细胞(图3c, 3d, 3g, 3h)。

不同的是, 处理组雌鱼在白消安及其与高温联合处理后并未发生生殖细胞凋亡现象(图4)。在处理第14天、第28天时, 对照组雌鱼卵巢内存在大量卵母细胞(图4a, 4e); 而Bu10组、Bu40组及Bu40H组雌鱼卵巢内同样存在大量卵母细胞, 卵母细胞完整, 并未出现空腔(图4)。

2.3 基因表达

荧光定量PCR分析发现白消安及其与高温联合处理后, 处理组雄鱼精巢内基因表达量下降, 而雌鱼卵巢内基因表达量未受影响(图5a, 5c)。Bu40组及Bu40H组雄鱼精巢内基因表达量在处理第14天时与对照组相比显著下降(<0.05, 图5a), 并在处理第28天、第38天、第48天仍处于显著下降状态(<0.05, 图5a); Bu10组雄鱼精巢内基因表达量在处理第14天时与对照组相比显著上升(<0.05, 图5a), 但在处理第28天时显著下降, 且处理第38天、第48天仍处于显著下降状态(<0.05, 图5a)。不同的是, 处理第14天至第48天间, 处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雌鱼卵巢内基因表达未出现显著下降现象(图5c)。

处理后雄鱼精巢内基因及雌鱼卵巢内基因的表达量并未下降(图5b, 5d)。在处理第14天时, 处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雄鱼精巢内基因表达量与对照组相比均显著上升(<0.05, 图5b);在处理28天时, Bu10组及Bu40H组雄鱼精巢内基因表达量与对照组相比无显著差异(>0.05, 图5b); 除Bu10组雄鱼精巢内基因表达量在处理第38天有显著下降外(<0.05, 图5b),其余处理组(Bu40组及Bu40H组)在处理第38天、第48天精巢内基因表达量均未显著下降(图5b)。处理第14天时各处理组(Bu10组, Bu40组及Bu40H组)雌鱼卵巢内基因表达量与对照组相比无显著差异(>0.05, 图5d); Bu10组及Bu40组雌鱼在处理第28天基因表达量显著下降(<0.05, 图5d), 但在处理第38天恢复正常; 在处理第48天时Bu40组基因表达量有显著下降(<0.05, 图5d)。

图1 白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼生长、性腺重及GSI的影响

注: a. 雄鱼体重; b. 雄鱼性腺重; c. 雄鱼GSI; d. 雌鱼体重; e. 雌鱼性腺重; f. 雌鱼GSI

图2 不同处理组黄姑鱼的存活率比较

2.4 原位杂交

对处理14天时各组雌雄鱼性腺内的基因进行原位杂交分析, 结果发现对照组雄鱼性腺内有强烈的基因阳性信号(图6a), 对照H.E染色图可知, 信号主要集中于生殖细胞(精母细胞)所在区域(图6c); 而Bu40组雄鱼性腺内的基因阳性信号较弱(图6d), 组织切片发现此时精巢内基本没有生殖细胞(图6f)。在雌鱼中, 对照组雌鱼性腺内有强烈的基因阳性信号(图7a), 组织切片发现信号主要集中于卵母细胞的胞质内(图7c); 而Bu40组雌鱼性腺内也存在强烈的基因阳性信号(图7d), 集中于卵母细胞的胞质内(图7f)。因此, 白消安处理后雄鱼基因表达显著下降, 而雌鱼未受影响。

图3 不同处理组雄鱼性腺的组织学观察

注: a—d为各组第14天时的精巢, e—f为各组第28天的精巢; a & e. Con组; b & f. Bu10组; c & g. Bu40组; d & h. Bu40H组; 比例尺为20 μm

图4 不同处理组雌鱼性腺组织学观察

注: a—d为各组第14天时的卵巢, e—f为各组第28天的卵巢; a & e. Con组; b & f. Bu10组; c & g. Bu40组; d & h. Bu40H组; 比例尺为20 μm

图5 白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼的vasa、dmrt1和cyp19a基因表达的影响

注: a. 雄鱼基因表达量; b. 雄鱼基因表达量; c. 雌鱼基因表达量; d. 雌鱼基因表达量

图6 处理14 d时不同处理组雄鱼性腺vasa基因原位杂交图

注: a—c为对照组第14天时的精巢, d—f为Bu40组第14天的精巢; a & d.基因T7探针原位杂交图; b & e.基因SP6探针原位杂交图; c & f. 性腺组织学切片图; 其中T7为反义探针, SP6为正义探针。原位杂交图中深色区域为阳性信号区域; 比例尺为20 μm

图7 处理14 d时不同处理组雌鱼性腺vasa基因原位杂交图

注: a—c为对照组第14天时的卵巢, d—f为Bu40组第14天的卵巢; a & d.基因T7探针原位杂交图; b & e.基因SP6探针原位杂交图; c & f. 性腺组织学切片图; 其中T7为反义探针, SP6为正义探针。原位杂交图中深色区域为阳性信号区域; 比例尺为20 μm

3 讨论

在鱼类生殖细胞移植中, 清除受体的内源性生殖细胞, 会显著提高移植效率(Nóbrega, 2009; Majhi, 2014)。在淡水和模式鱼类中, 已有研究证明白消安和高温处理会导致生殖细胞凋亡(Lacerda, 2006, 2010; Majhi, 2009a, b; Nóbrega, 2010), 然而针对海水鱼类的相关研究较少。本研究采用白消安和高温联合处理黄姑鱼, 我们观察到注射白消安后第14天各组的雄鱼性腺内均出现空腔, 其中Bu40组效果最佳, 基本消除了精子和精母细胞; 相比于白消安处理组, 高温-白消安联合处理组的效果并没有显著增强, 且出现较高的死亡率, 因此关于温度对黄姑鱼生殖细胞的影响还需要进一步研究。

本研究中, 白消安和温度处理仅对消除雄鱼生殖细胞有效, 对于雌鱼生殖细胞的消除并不理想, 因此白消安对雌雄黄姑鱼的影响表现出明显的性别差异。在鲤()中发现白消安处理后其雌雄鱼的生殖细胞均受到影响(Majhi, 2017), 而银汉鱼则是对雄鱼的消除效果要强于雌鱼(Majhi, 2009a), 这说明白消安对鱼类生殖细胞的影响可能因鱼种而异。高温对鱼类生殖细胞的影响也是值得注意的, 已有研究表明单独的高温处理(25 °C)也能消除银汉鱼的生殖细胞(Majhi, 2009a)。在罗非鱼中还发现较低的温度(20 °C)更易使雄鱼生殖细胞凋亡(de Alvarenga, 2009), 表明高温并不一定促进鱼类生殖细胞凋亡。本研究发现白消安-高温处理组与白消安处理组对生殖细胞的影响无明显差异, 并未表现出联合处理的累加效果。但是, 由于本研究仅设置了一个温度处理, 还需要进一步的试验来明确温度对黄姑鱼生殖细胞的影响。

性腺成熟指数GSI能反映鱼类性腺的饱满程度。在处理期间, 雄鱼的GSI有显著下降, 随后恢复正常, 雌鱼GSI并无明显变化, 这与组织学观察结果基本一致。基因是生殖细胞的标记基因, 主要在鱼类的生殖细胞中表达(Boonanuntanasarn, 2016; Duangkaew, 2019)。本研究通过荧光定量PCR对黄姑鱼性腺基因进行定量分析, 结果发现实验期间Bu10组、Bu40组、Bu40H组的雄鱼性腺内基因表达较对照组均有显著下降且在处理结束后较长一段时间内仍处于下调状态, 而雌鱼性腺内基因表达则无显著变化; 同样,基因的原位杂交结果也表明基因在处理组的雄鱼精巢内表达显著下降, 而在雌鱼卵巢内的表达并没有显著影响。在鲤鱼(Majhi, 2017)、银汉鱼(Majhi, 2009a)等鱼类上也发现白消安处理后实验鱼性腺内的基因表达被抑制, 甚至在结束处理10周后仍被抑制。和分别是雌雄鱼的体细胞标记基因, 这两个基因的表达分析发现白消安和白消安-高温处理并没有显著影响其表达, 表明上述处理可能对性腺体细胞没有显著影响。

在高温和白消安的处理过程中, 鱼体受到的损伤也是非常值得关注。白消安具有毒性, 其安全剂量因物种而异, 过量的剂量可能会引起实验对象的死亡(Ogawa, 1999)。对小鼠的研究表明若是剂量过大会使小鼠中毒, 导致白消安无法有效清除其体内的生殖细胞(Brinster, 2003)。在鱼类中, 白消安的毒性存在性别差异性: 当以40 mg/kg剂量处理1龄银汉鱼时, 雌雄鱼内源性生殖细胞均凋亡, 雄鱼能正常存活而雌鱼皮肤出现溃疡并有较高的死亡率(Majhi, 2009a)。本研究中, 单独注射白消安并未造成黄姑鱼死亡, 因此推测实验的注射剂量是适宜的。但是, 高温-白消安联合处理组出现较高的死亡率, 这可能是由于二者联合作用导致鱼体机能受到影响, 容易造成病菌感染而引发死亡。

4 结论

综上, 白消安处理能够消除黄姑鱼雄鱼精巢内的生殖细胞, 但对雌鱼生殖细胞的消除效果并不明显; 而且, 白消安处理并不会影响其体细胞。在实际应用中, 由于高温处理容易造成较高的死亡率, 因而不宜使用。通过上述实验的优化, 本研究认为采用40 mg/kg浓度两次间隔注射白消安能够制备不育黄姑鱼。

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EFFECTS OF BUSULFAN AND ITS COMBINED TREATMENT WITH HIGH TEMPERATURE ON GONADAL DEVELOPMENT OF YELLOW DRUM ()

YANG Lei1, 2, 3, HU Wei-Hua2, 3, YU Yan-Jie1, 2, 3, CHEN Rui-Yi2, 3, XU Dong-Dong2, 3

(1. College of Fisheries, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan 316021, China; 3. Key Laboratory of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China)

Yellow drum () is a suitable recipient for germ cell transplantation due to its short sexual maturation and fully-developed aquaculture technology. Sterile recipient fish is critical for the success of germ cell transplantation. To optimize the preparation method of sterile yellow drum, we use treatments of busulfan-only and busulfan-high-temperature to the yellow drums.Five groups were set up: the control (Con), groups with 10 mg/kg busulfan injection (Bu10), 40 mg/kg busulfan injection (Bu40), 10 mg/kg busulfan injection in high temperature (30 °C) (Bu10H), and 40 mg/kg busulfan injection in high temperature (30 °C) (Bu40H). Busulfan was injected intraperitoneally twice on Day 1 and Day 14, respectively, in above-mentioned experimental dosages. The histology, qPCR, andhybridization were used to analyze the effects of busulfan and the high-temperature combination treatment on the development of gonads, germ cells, and somatic cells. Results show significant gender difference in the effect of busulfan treatment on the germ cells of yellow drum. On Day 28 post treatment, the gonad weight and GSI of male yellow drum decreased significantly compared with those of the control group. Histological observation revealed that cavities in the testis of male individuals were observed on Day 14 post treatment. The qPCR analysis showed that theexpression in males was significantly decreased during treatment and remained down-regulated on Day 48 post treatment. However, busulfan-only and busulfan-high-temperature combination treatment had insignificant effect on the germ cells of females. However, the high temperature treatment resulted in high mortalities while the elimination of male germ cells was not significantly enhanced. Therefore, the germ cells in the male gonad could be eliminated by busulfan treatment, and the best treatment was busulfan injection at 40 mg/kg in an interval of about two weeks, which is suitable for the preparation of recipient fish for germ cell transplantation.

yellow drum (); busulfan; germline cell transplantation;;hybridization

* 国家自然科学基金项目, 31972785号; 浙江省杰出青年基金项目, LR21C190001号; 浙江省海水增养殖重点实验室开放课题, 2020KF013号。杨 磊, 硕士研究生, E-mail: yanglei-1996@qq.com

徐冬冬, 研究员, E-mail: xudong0580@163.com

2021-04-25,

2021-07-13

Q955; Q789; S965.325

10.11693/hyhz20210400104