黄芪多糖对脾虚湿困大鼠胃肠功能的调节及肠黏膜损伤修复的机制研究

杨彬彬 崔 宁 张亚楠 赵文晓 王世军

1.山东中医药大学健康学院，山东济南 250355；2.山东中医药大学中医学院，山东济南 250355；3.山东中医药大学护理学院，山东济南 250355

现代研究认为中医“脾”是涉及消化吸收、能量转化、水盐代谢、内分泌系统、免疫系统等的综合功能单位，脾虚证主要表现为以消化系统为主的多系统多器官的功能低下。胃肠黏膜损伤是脾虚证常见病变之一，益气健脾中药对脾虚证患者胃肠道病变有改善作用。黄芪味甘，微温；入脾、肺经；补中益气、固表利水、托脓毒和生肌[1]。现代药理研究发现黄芪具有抗肿瘤、保护肠功能等作用[2]。黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）作为黄芪的主要化学成分之一，可以作用于人体多个系统，具有增强免疫系统功能、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化等作用[3-4]。

Wnt 信号通路作为人体较为保守的信号途径，对生命体的大多数生物学现象都有调控作用[5]，包含多种信号传导途径，Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路是Wnt 经典途径，已经被证明与很多疾病的发生和发展相关，该信号通路激活后会促使人体包括肿瘤细胞在内的多细胞不断增殖，形成增生性、炎症性和肿瘤性病变。本实验通过研究APS 调控Wnt 信号通路对大鼠肠道吸收功能及小肠黏膜损伤的影响，初步探讨APS 修复肠道黏膜损伤机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar 雄性大鼠50 只，4 周龄，体重（150±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司购（实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，合格证号：1100111911015209）。SPF 级环境喂养。按照国家部属实验动物管理委员会制订的标准饲养，并经本单位实验动物伦理委员会批准。动物房温度23～25℃，相对湿度40%～50%，光照时间7∶00～19∶00。

1.2 药物

APS，购于Solarbio 公司，批号：716D032，4℃保存备用。

1.3 主要试剂及仪器

大鼠淀粉酶酶联免疫吸附试验（enzyme-linked im munoadsordent assay，ELISA）试剂盒（批号：200107KE5）、大鼠胃泌素ELISA 试剂盒（批号：200107KE8）、大鼠胃动素ELISA 试剂盒（批号：200107KE9）、大鼠D-木糖ELISA 试剂盒（批号：200107KE10）、大鼠琥珀酸脱氢酶ELISA 试剂盒（批号：200107KE11）均购自江苏晶美生物科技有限公司。Wnt1（货号：PAB40578）、βcatenin 抗体（货号：PAB30671）均购自Bioswamp 武汉贝茵莱生物科技有限公司；TG16W 微量高速离心机（湘仪集团）；GNP-9080 型隔水式恒温培养箱（上海精宏）；AC8 洗板机（芬兰热电）；352 型酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS）。

1.4 研究方法

1.4.1 造模 大鼠适应性喂养3 d，按照随机数字表法分为对照组、模型组、APS 高剂量组、APS 中剂量组、APS 低剂量组，每组10 只。除对照组（不作任何处理，正常饲养）外，其余各组按照前期本课题组模型制备方法造模，具体造模方法为：大鼠每日饲以高脂低蛋白饲料加力竭游泳，连续8 周，建立脾虚湿困大鼠模型[6]。对照组饲以AIN-76A 纯化饲料。各组均自由进食、饮水。

1.4.2 给药 造模成功后，于造模结束后次日APS 高剂量组按照900 mg/（kg·d）、APS 中剂量组按照600 mg/（kg·d）、APS 低剂量组按照300 mg/（kg·d）灌胃，1 次/d，每次1 ml/100 g，连续2 周，对照组和模型组给予同体积生理盐水，灌胃。观察大鼠一般状况并记录大鼠体重变化情况。

1.4.3 标本采集 各组大鼠麻醉后，腹主动脉采血，室温静置2 h 后低温离心（4℃，3000 r/min，10 min，离心半径10 cm），将血清放置于-20℃低温冰箱中，备用。取小肠组织，置于4%多聚甲醛液中固定。

1.4.4 血清D-木糖、胃泌素、胃动素、琥珀酸脱氢酶、淀粉酶检测 按照试剂盒说明，采用双抗体夹心ELISA检测各组大鼠血清淀粉酶、D-木糖、胃动素、胃泌素、琥珀酸脱氢酶水平。

1.4.5 小肠黏膜病理学及免疫组织化学检测 小肠组织常规石蜡包埋，制作3～4 μm 石蜡切片，取各组大鼠小肠组织在10%中性甲醛中固定24 h 后进行脱水、透明处理，石蜡包埋，3～4 μm 切片，行常规HE 染色，于显微镜下观察病理改变。

将包埋好的组织进行切片，厚度为3 μm；水浴展片，捞片，烤片，常规脱蜡水化；柠檬酸钠缓冲溶液中高压抗原修复；10%山羊血清中封闭；滴加Wnt1、βcatenin 一抗（1∶50 稀释），4℃孵育过夜，次日放置室温下复温，滴加二抗（1∶50 稀释），湿盒孵育，37℃孵育60 min。DAB 染色，苏木精复染，样本经75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ分别浸泡5 min 脱水，封片。在200 倍显微镜下观察Wnt1、β-catenin 蛋白的表达，使用Mantra 图像分析软件对两种目标蛋白进行光密度（optical density，OD）半定量分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

对照组一般状况稳定，进食正常，体重稳定上升，活泼好动，大小便正常，毛色光泽。与对照组比较，模型组逐渐出现食欲不振、神倦懒动、眯眼、被毛无光等状况。

2.2 APS 对脾虚湿困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影响

与对照组比较，模型组血清淀粉酶、D-木糖水平显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，APS 高、中、低剂量组血清淀粉酶水平升高，APS 高剂量组D-木糖水平显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表1。

表1 APS 对脾虚湿困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影响（）

表1 APS 对脾虚湿困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影响（）

注：与对照组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黄芪多糖

2.3 APS 对脾虚湿困大鼠血清胃动素、胃泌素的影响

与对照组比较，模型组血清胃动素、胃泌素水平均显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，APS 高剂量组血清胃泌素水平升高，差异有统计学意义（P ＜0.05），APS 低剂量组、中剂量组血清胃动素水平显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表2。

表2 APS 对脾虚湿困大鼠血清胃泌素、胃动素水平的影响（pg/ml，）

表2 APS 对脾虚湿困大鼠血清胃泌素、胃动素水平的影响（pg/ml，）

注：与对照组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黄芪多糖

2.4 APS 对脾虚湿困大鼠小肠黏膜病理形态学的影响

对照组小肠黏膜完整，绒毛表皮较完整，细胞排列整齐，黏膜层上皮细胞排列整齐，固有层内无或有少量炎症细胞浸润，间质未见明显水肿，见图1A。与对照组比较，模型组小肠绒毛排列紊乱、变短，表皮细胞出现明显凋亡与坏死，固有层毛细血管扩张充血明显，间质有少量中性粒细胞浸润，见图1B；与模型组比较，APS 各组小肠绒毛相对完整，细胞排列相对整齐，黏膜上层细胞排列相对整齐，固有层有少量炎症细胞浸润，间质未见明显水肿，见图1C～E。

图1 APS 对脾虚湿困大鼠病理形态学影响（HE 染色，200×）

2.5 APS 对脾虚湿困大鼠小肠黏膜损伤相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组Wnt1、β-catenin 蛋白表达显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，APS 高、中、低剂量组Wnt1、β-catenin 蛋白水平均显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图2～3，表3。

表3 APS 对脾虚湿困大鼠小肠黏膜蛋白Wnt1、β-catenin 水平影响（）

表3 APS 对脾虚湿困大鼠小肠黏膜蛋白Wnt1、β-catenin 水平影响（）

注：与对照组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黄芪多糖

图2 APS 对脾虚湿困大鼠肠黏膜Wnt1 蛋白表达的影响（免疫组化，200×）

图3 APS 对脾虚湿困大鼠肠黏膜β-catenin 蛋白表达的影响（免疫组化，200×）

3 讨论

脾虚湿困是中医常见证型，是主要以消化系统功能障碍为主的一种全身性综合病理状态[7-8]，大量研究表明脾虚证患者及动物易出现肠黏膜上皮细胞损伤及吸收障碍[9-10]。张介宾《类经·藏象类》曰“小肠居胃之下，受盛胃中水谷而分清浊，水液由此而渗于前，糟粕由此而归于后，脾气化而上升，小肠化而下降”。可见胃肠功能紊乱尤其是小肠的吸收功能下降在脾虚湿困发病机制中起到重要作用，而肠黏膜损伤导致通透性增高，引起肠道细菌和毒素移位，消化吸收功能下降，可能是脾虚湿困的发病机制。

黄芪性温，补脾和胃，补气生血，温升，利水[11-12]。APS 作为其主要活性成分，具有保肝、降血糖、抗病毒、抗氧化延缓衰老等作用[13-18]，有研究显示APS 可加速胃肠黏膜损伤早期修复过程[19]。

血清淀粉酶活性的强弱是消化酶分泌功能的特异性指标[20]。胃动素主要生理活性是诱发胃强烈收缩和小肠的分节运动，刺激胃蛋白酶和胰液的分泌[21]。本实验中，APS 低、中剂量组血清淀粉酶及胃动素水平均较模型组升高，提示APS 能够提高消化酶分泌，促进肠蠕动。胃泌素、D-木糖浓度可以间接反映脾气虚证的严重程度及治疗后的恢复情况[22]。本研究中，脾虚湿困大鼠血清胃泌素分泌减少、D-木糖水平下降，反映小肠吸收功能障碍，APS 干预后，APS 高剂量组胃泌素及D-木糖水平均较模型组显著升高，提示APS 可以在一定程度上改善脾虚症状，使消化道黏膜得以修复，提高吸收功能。

Wnt 信号通路是在后生动物细胞内高度保守的关键信号通路，Wnt/β-catenin 信号通路是上世纪80 年代最先在动物研究中被发现[23]。其参与调控胚胎的早期发育、成体的组织稳态维持、干细胞自我更新、细胞命运决定、细胞分裂及肿瘤发生发展等多种生物学过程[24-29]。

Wnt 通路的组成主要包括细胞外因子、跨膜受体Frizzled、β-catenin 及T 细胞趋化因子4 等一系列蛋白。Wnt/β-catenin 通路是Wnt 通路中最为经典的信号通路。当Wnt/β-catenin 通路异常激活时，多种因子可与β-catenin 相互作用，使得β-catenin 由胞质转移至核内，竞争性结合T 细胞趋化因子4，抑制T 细胞趋化因子4 的转录激活，从而诱导细胞发生增生性、炎症性或者肿瘤性病变[30-31]。本实验条件下，脾虚湿困大鼠小肠黏膜损伤、Wnt1、β-catenin 蛋白表达异常升高，APS 通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路，下调了Wnt1 及β-catenin 的表达，改善了肠黏膜损伤及胃肠功能，发挥其益气健脾祛湿的功效。

本实验对APS 高、中、低3 个剂量在提高脾虚湿困大鼠胃肠功能及修复肠道黏膜损伤机制方面进行深入研究。本实验以前期研究为基础，以大鼠血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素、胃动素等指标变化反映脾虚湿困大鼠胃肠消化吸收功能的下降，小肠黏膜病理学形态结果及Wnt1、β-catenin 蛋白表达的变化提示这可能与肠黏膜损伤有关。APS 干预后，结果显示肠黏膜损伤及胃肠功能紊乱得到一定程度改善，提示其机制可能与调节Wnt 信号通路有关。课题组将进一步就APS 如何通过Wnt 信号通路修复肠道黏膜损伤从而发挥健脾祛湿机制进行深入研究。