丹参多酚酸盐对PM2.5所致心肌损伤的保护作用及其机制

谢德，杨彬，郑锡锋

广东医科大学附属医院老年医学科,广东湛江 524001

大气细颗粒物（PM2.5）则是大气颗粒物中空气动力学直径＜2.5μm的部分，又称为细颗粒物，现代流行病学调查及基础研究均表明短期或长期暴露于大气可吸入颗粒物PM2.5可导致人体多系统损害，特别是心血管系统及呼吸系统[1]。大气颗粒物暴露能增加人群心血管疾病患病和病死的风险[2]，特别是心肌梗死、高血压、心律失常和心力衰竭[3-4]。Marchini等[5]的研究结果表明,暴露在PM2.5的时间与心率变异率(HRV)之间有正相关的关系。PM2.5组成复杂,PM2.5的主要作用是其到达肺泡后在肺泡中沉积,然后通过血液循环到达全身各个器官系统,激活氧化应激反应诱发全身器官损害从而严重危害人体健康[6]。PM2.5到达肺泡组织后，被肺巨噬细胞吞噬,刺激巨噬细胞释放炎性因子等诱发炎性反应。这些炎症因子会直接或间接导致心肌细胞损伤等[7]。颗粒物刺激产生的炎性因子及血管活性成分进入血液循环后引发全身性氧化应激以及炎症反应[8]。流行病学研究显示，PM2.5与心血管系统疾病，特别是心肌梗死，有直接的关系。大量研究表明丹参多酚酸盐可以通过血管炎性反应达到保护心肌，减少心血管事件的发生。但对PM2.5所致心肌损伤丹参多酚酸盐是否具有保护作用尚未得到证实，该研究通过PM2.5作用于大鼠，观察是否引起氧化应激以及心肌细胞凋亡，在药物组大鼠使用丹参多酚酸盐了解是否产生保护作用，从而阐明丹参多酚酸盐在PM2.5导致心肌损伤的保护机制。报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品与试剂

36只SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，戊巴比妥钠盐、乌拉坦、化学纯，用生理盐水配制成25%的溶液。肝素钠注射液（2 mL∶12 500 U）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，TUNEL试剂盒，瑞士罗氏公司；丹参多酚酸盐。

1.2 处理方法

PM2.5的收集和处理使用MODEL一120A型大容量采样器(配合2.5μm的旋风分级器，纪本电子)采集夏季市区主干道旁大气中2.5μm以下的细颗粒物，吸气流量为1.12 m3／min，连续2 d采样，采集颗粒物样品集中在玻璃纤维滤膜上。然后把滤膜剪成多个小块，与超纯水混合后超声处理600 s，清除纤维滤膜。把颗粒物悬液在真空中冷冻干燥，称取重量后采用低温保存。在使用时加入0.9%氯化钠溶液制成25 mg/mL的颗粒物悬液，在超声下振荡15 min，悬混匀液并灭菌。

1.3 大鼠分组与染毒

36只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组，研究组，药物组3组，每组12只；研究组大鼠经气管内缓慢注入颗粒物悬液染毒（25 mg/kg剂量），每周染毒2次，连续染毒4周；对照组以0.9%氯化钠溶液代替颗粒物悬液，药物组除按25 mg/kg剂量经气管内缓慢注入颗粒物悬液染毒，每周染毒2次，连续对大鼠染毒4周以外还同时给予丹参多酚酸盐15 mg／kg体质量灌胃，1次/d，连续4周。

1.4 检测方法与指标

应用生物信号处理系统测定大鼠的心率和血压；于腹主动脉取血，3 000 r／min离心10 min(离心半径：26 cm)后取血清大鼠血清中SOD、MDA指标测定严格按照试剂盒说明书进行。3组SD大鼠于第4周染毒后次日处死后立即取出心室心底部的心肌标本，以4%多聚甲醛固定在12 h后用于TUNEL检测心肌细胞凋亡。TUNEL心肌细胞凋亡检测依据试剂盒说明书进行，以及计算出心肌细胞凋亡比例（凋亡率=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100.00%）[9]。采用DXC800全自动生化分析仪测定肌酸激酶和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。

1． 5统计方法

2 结果

2.1 3组SD大鼠心率及血压的对比

研究组大鼠的心率明显高于对照组[(452±12)次/min vs(337±16)次/min]，差异有统计学意义(P＜0.05)。研究组大鼠平均动脉压高于对照组大鼠[(112±5)mmHg vs(90±3)mmHg]，差异有统计学意义(P＜0.05)。药物组心率及血压为(403±19)次/min，(98±2)mmHg，与研究组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同组别大鼠的血压及心率比较(±s)

表1 不同组别大鼠的血压及心率比较(±s)

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2.2 各组大鼠氧化应激指标的比较

研究组大鼠的SOD、MDA与对照组比较分别为(11.38±3.02)U/mL vs(32.26±3.12)U/mL，(90.21±3.46)nmol/mL vs(40.25±3.02)nmol/mL，差异有统计学意义(P＜0.05)。研究组大鼠的SOD、MDA与药物组比较分别为(11.38±3.02)U/mL vs(27.32±3.16)U/mL，(90.21±3.46)nmol/mL vs(72.12±3.12)nmol/mL，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠SOD及MDA水平比较(±s)

表2 各组大鼠SOD及MDA水平比较(±s)

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2.3 各组大鼠酶学指标比较

研究组与对照组肌酸激酶及CK-MB分别为(1 258±59)U/L vs(537±24)U/L，(296±31)U/L vs(132±27)U/L，差异有统计学意义(P＜0.05)。药物组大鼠血清中肌酸激酶及CK-MB含量分别为(863±24)U/L、(164±31)U/L，与研究组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠酶学水平比较[(±s),U/L]

表3 各组大鼠酶学水平比较[(±s),U/L]

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2.4 各组大鼠心肌凋亡比例的对比

研究组、对照组、药物组大鼠心肌细胞凋亡比例分别为(3.85±1.03)%、(1.12±0.38)%、(2.05±0.12)%；对照组大鼠心肌细胞凋亡比例明显低于研究组，差异有统计学意义(P＜0.05)，药物组大鼠心肌细胞凋亡比例明显低于研究组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 各组大鼠心肌凋亡比例比较[(±s),%]

表4 各组大鼠心肌凋亡比例比较[(±s),%]

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3 讨论

随着大气污染日益严重，PM2.5作为污染源主要成分之一，日益受到人们关注。长时间吸入PM2.5可对心血管系统造成严重的损害。这种损害可以通过直接或间接的机制造成。目前对间接机制研究较多，主要是通过氧化应激的机制形成氧自由基达到损害细胞组织的作用[10]。正常生理条件下，体内的活性氧自由基（ROS）处在动态平衡的关系，ROS过多，超出体内清除及调节能力时就会对细胞组织造成损害。PM2.5中的过渡金属及有机物成分是促使细胞产生ROS的主要成分。ROS会引起细胞膜磷脂中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,产生多量的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),而大量的ox-LDL则会引起动脉粥样硬化。MDA是活性氧自由基与细胞膜发生脂质过氧化反应后的重要的产物。ROS能直接损害核酸,进而引起DNA损伤,影响细胞的功能和周期。当机体受到PM2.5刺激,产生过多的ROS活性氧自由基后，打破机体内的氧化还原平衡，超氧化物歧化酶减少，ROS就会对各种生物大分子和各种细胞造成破坏，最终会导致心肌细胞等发生变化,从而引起高血压、动脉粥样硬化、心肌梗塞等心血管疾病[11-14]。这可能是研究组大鼠ROS激活后导致心肌细胞损伤后引发肌酸激酶及肌酸激酶同工酶升高同时血压升高的原因。而研究组的MDA较其他两种升高也表明ROS在PM2.5损害心肌细胞机制发挥的作用。流行病学研究也证实PM2.5与心肌梗死发病率呈现明显正相关[15]。

ROS不仅引起心肌细胞损伤，还会促进心肌细胞凋亡[16-17]。主要是有活性氧直接损伤细胞DNA，上调凋亡基因的表达，下调抑凋亡基因表达，抑制SOD生成等机制共同作用[18-20]。罗斌等[20]研究表明不同的温度暴露在PM2.5中的大鼠均有不同程度的MDA上升及SOD下降。既往研究表明暴露于PM2.5的患者收缩压平均升高6 mmHg，动脉粥样硬化斑块面积增加，NADPH氧化酶活性上升。该研究中，研究组大鼠的血压心率较对照组升高，可能与PM2.5导致机体内氧化应激代谢物水平升高，心肌耗氧量上升，引起动脉粥样硬化，从而刺激血压及心率升高。研究组的MDA、心肌酶上升及心肌细胞凋亡增加，具有细胞保护作用的SOD减少，结合ROS对心肌损伤的机制表明，PM2.5引起ROS活性上升后，导致研究组大鼠的心肌细胞DNA损伤进而导致细胞损害，引起心肌酶上升及细胞凋亡比例增加。已有多项研究表明丹参多酚酸盐对血管具有抗氧化抗炎作用，可以减少心血管事件发生[21-22]。在吸入PM2.5的同时使用丹参多酚酸盐的药物组大鼠无论是MDA、还是血压心率都较研究组大鼠明显减低，SOD上升。表明丹参多酚酸盐可以降低由PM2.5引起的ROS升高导致对心血管系统产生的不良影响。同时药物组大鼠的细胞凋亡比例及心肌酶也明显下降，SDO升高，可能与丹参多酚酸盐可以通过抑制ROS的活性减轻心肌耗氧量及动脉粥样硬化等的机制起到心肌保护作用有关。

综上所述，丹参多酚酸盐可能对PM2.5诱发ROS活性升高而导致心血管损害这一作用通路方面有保护作用。