蒿甲醚对痤疮丙酸杆菌体外抑制作用研究

王国江， 陈向明， 沈文彤， 裴琴， 张海清， 何慧琼

1.上海健康医学院附属周浦医院,上海 201318；2.上海市嘉定区南翔医院，上海 201802

痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes,P.acnes)是一种革兰染色阳性的厌氧菌，是与痤疮发病密切相关的病原微生物之一[1]。P.acnes能通过激活胰岛素样生长因子1受体使角质形成细胞增殖，增加皮脂分泌，使毛囊漏斗部角化，并形成炎症反应[2]。故抗菌治疗是痤疮治疗的重要方法之一。鉴于目前抗生素耐药问题日趋严重[3]，探索新型抗P.acnes药物有重要意义。青蒿类药物具有较高的安全性与耐受性。自制蒿甲醚乳剂对痤疮及玫瑰痤疮均治疗有效，复发率低[4-5]，但其治疗机制尚未明了。本文拟探索蒿甲醚对P.acnes的体外抑菌、协同抗菌作用及其对P.acnes菌体形态影响。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

P.acnes标准株由上海健康医学院微生物实验室提供。P.acnes菌株来自上海健康医学院附属周浦医院痤疮患者皮疹培养鉴定的P.acnes，共10株。

1.2 试剂与设备

厌氧菌肉汤培养基(青岛日水生物技术公司)，厌氧血琼脂平板(南通凯恒生物科技)，一般血琼脂平板及革兰染色液(南京森贝咖公司)，厌氧袋(日本三菱公司)，蒿甲醚(华武制药)。多西环素针(广东卫伦生物制药)。扫描电子显微镜S-4800型(日立公司)，比浊仪(Phoenix SpecTM)，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(布鲁克-道尔顿公司)。

1.3 方法

1.3.1P.acnes菌株的培养、鉴定与储存 用无菌取样拭子在痤疮患者的丘疹与脓疱表面摩擦取样，接种于厌氧培养基，置于厌氧袋内37 ℃培养48 h。取菌落分别接种到普通及厌氧培养盒，再放入CO2培养箱，培养2 d取厌氧培养盒里的菌落，在载玻片固定，革兰染色后镜检。选择纯化培养的单个菌落，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统鉴定菌种。确认后的P.acnes菌株置于-80 ℃冰箱储存待用。

1.3.2 药物最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)检测 测量蒿甲醚和盐西环素对P.acnes的MIC。先将100 μL肉汤加入实验板的待测孔，第1排每孔加100 μL药液，依次向下排进行倍比稀释，到11排为止。将蒿甲醚、多西环素分别溶解，再配制蒿甲醚与盐酸多西环素药液，初始浓度分别为5 000 μg/mL与2.56 μg/mL，其中盐酸多西环素浓度是对标组织内溶度。将100 μL 105CFU/mL的菌液加入待测药液内，37 ℃厌氧培养,48 h观察培养结果，以肉眼观察不出现浑浊的最低浓度为药物的MIC，每菌株设2个平行试验，设阴性对照和阳性对照。

1.3.3 联合药物敏感性试验 用微量稀释法测定蒿甲醚及盐酸多西环素联合应用时的体外抗菌活性，重测2次，起始浓度为对应各药MIC的2倍。以分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)指数为联合用药敏感性指标[6]。FIC指数≤0.5为两药协同作用；>0.5～1为两药相加作用；>1～2为两药无关作用；>2为两药拮抗作用。FIC指数=(A药联合MIC/A药单测MIC)+(B药联合MIC/B药单测MIC)。

1.3.4 电镜观察两组菌体形态 取100 μL浓度为105CFU/mL的P.acnes标准菌菌液，加至2 mL厌氧培养肉汤培养基中，厌氧培养24 h。实验组加入药物浓度为MIC的蒿甲醚，对照组为不加药物的细菌培养液，均培养24 h后收集培养液；1 000 g离心10 min，取试管底部细菌，再用2%戊二醛固定2 h，采用扫描电子显微镜观察两组细菌形态的差异。每组随机选取某个视野相邻的10个菌体，分别测量菌体长度。

1.3.5 统计学处理 用SPSS 22.0软件进行统计处理，蒿甲醚体外抑菌实验的组间浓度比较以及实验组与对照组菌体长度比较均采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌种鉴定结果

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对分离疑似P.acnes的10个临床菌株进行鉴定，结果显示均与标准P.acnes菌株一致。

2.2 体外抑菌试验结果

单药组内，蒿甲醚对P.acnes的MIC为(117.19±76.15)μg/mL，盐酸多西环素对P.acnes的MIC为(0.08±0.05)μg/mL。联合用药组内，蒿甲醚作用P.acnes的MIC为(31.96±19.58)μg/mL，而盐酸多西环素作用P.acnes的MIC为(0.02±0.01)μg/mL。联合用药组蒿甲醚的MIC值与单独蒿甲醚组的MIC值间差异有统计学意义(t=4.03,P<0.01)。表明蒿甲醚与盐酸多西环素联合使用可抑制P.acnes的标准菌株与临床菌株生长，其中有5个菌株呈协同作用，6个菌株呈相加作用。详见表1。

表1 蒿甲醚与多西环素在单药组与联合用药组的MIC及FIC

2.3 菌体形态学变化

蒿甲醚作用菌株24 h后，扫描电镜下观察对照组与实验组的菌体形态,可见对照组菌体较长、菌壁光滑、菌体舒展，实验组菌体较短菌壁粗糙、菌体相互扭曲(图1)。测量结果显示，对照组菌体长度为(19.80±3.08)μm，实验组菌体长度为(13.40±4.47)μm,两者差异有统计学意义(t=5.04，P<0.01)。

图1 扫描电镜观察两组菌体形态

3 讨论

痤疮是一种好发于青春期、主要累及面部毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性皮肤病。中国痤疮治疗指南[7]指出,对于轻中度痤疮，可外用林可霉素、夫西地酸等抗生素，因外用抗生素易诱导P.acnes耐药，建议与维A酸类或过氧化苯甲酰等联合应用。故探索新型敏感抗菌药物及联合抗菌用药方案有重要临床价值。青蒿类药物有较高安全性与耐受性，除了有抗疟原虫及抗炎作用外，还有抗细菌作用。近年来青蒿琥酯抗菌作用研究较多:青蒿琥酯对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有体外抑菌作用，且青蒿琥酯与头孢西丁联合使用，可降低头孢西丁的MIC[8]；高浓度的青蒿琥酯对MRSA WHO-2菌的细胞壁有轻微破坏作用[9]；青蒿琥酯与不同抗菌药物具有协同抗菌作用[10];口服青蒿琥酯治疗酒糟鼻的疗效与多西环素相当，但不良反应小[11],为青蒿类药物治疗痤疮类等疾病提供了借鉴。

从青蒿类抗菌机制来看，青蒿类药物的抗疟机理是该类分子含过氧桥结构，在血清铁离子的介导下，过氧桥结构容易发生断裂，从而释放氧自由基，可以直接破坏疟原虫的膜结构，导致疟原虫死亡。受到此机制启发，蒋为薇等[9]研究发现青蒿类药物对MRSA WHO-2菌壁有破坏作用，但在该菌药敏浓度以下时，对菌膜的破坏性不明显。本研究扫描电镜观察表明，细菌敏感浓度的蒿甲醚对P.acne细胞壁有明显破坏作用，菌壁表明粗糙不平，呈现树皮样结构，可能是细菌种类不同造成的。Silva等[12]发现千层香精油作用于李斯特菌时，会使该细菌变短小，表明细菌在不利生长的环境中会改变菌体大小，与本研究中蒿甲醚培养的P.acne较对照组P.acne菌体的变短小有一致性。研究发现细菌一氧化氮可以对抗药物的杀菌或抑菌作用，青蒿类药物可结合菌体内一氧化氮合酶(NOS)的血红素基团灭活NOS，减少地衣芽孢杆菌产生一氧化氮，来增强利福平的抗菌作用[13]。有研究表明P.acne可通过活性氧依赖的NF-κB级联反应诱导NOS、一氧化氮的表达[14]，因此蒿甲醚与盐酸多西环素对P.acne联合用药的疗效也值得进一步研究。

蒿甲醚抗疟原虫活性与青蒿琥酯相似[15]，我们预实验发现同浓度的蒿甲醚乳剂较青蒿琥酯乳剂的皮肤刺激小，更适合做外用制剂。研究发现，2.5～20 g/L蒿甲醚可体外抑制毛囊蠕形螨活性[16]，应用自制1%蒿甲醚乳剂对玫瑰痤疮的有效率略高于甲硝唑膏、且8周复发率明显降低[4]。蒿甲醚乳剂对痤疮治疗有效，且8周复发率低于夫西地乳剂[5]。本研究显示，蒿甲醚对体外P.acnes的抑菌作用可能是治疗痤疮主要机制之一。蒿甲醚对体外P.acnes的MIC值为(117.19±76.15)μg/mL，较陈向明等[17]报道的青蒿琥酯对P.acnesMIC值(1 071± 688 μg/mL)约低9.15倍，表明其抗P.acnes的作用强于青蒿琥酯，为开发该药的外用制剂治疗痤疮类疾病提供了实验依据。另外，蒿甲醚与多西环素对P.acnes的协同或相加的抑菌作用，在一定程度上为外用蒿甲醚乳剂联合口服盐酸多西环素提供了重要启示。

综上所述，本研究初步发现蒿甲醚可使P.acnes菌体长度缩短、菌壁粗糙、菌体互相扭曲，推测可能与该药物影响细胞壁菌体蛋白合成有关，但其确切抗菌分子机制还有待更深入的研究。同时，有研究表明生物膜在P.acnes的感染机制中起重要作用[18]，蒿甲醚是否可以破坏P.acnes的生物膜结构以及蒿甲醚的抗炎机制是否在治疗痤疮中发挥作用亦值得进一步探讨。