库德里阿兹威氏毕赤酵母在发酵工业中的研究进展

王德培，胡 阳，焦 富

（贵州茅台酒股份有限公司，贵州仁怀 564500）

在石器时代时，人类便已开始利用酵母发酵来增加食物和饮料的风味以及保存周期。乙醇发酵从最开始的自然发酵到如今过程受控制的工业发酵，发酵剂也由多菌种混合发酵转变为特定的单一菌种发酵，而酿酒酵母及其近源种是最常见也是应用最广泛的发酵剂。然而，使用酿酒酵母进行纯种发酵也有其局限性，一方面是很难筛选到一株同时满足所有优良性状的酵母，同时在传代扩培中也容易出现突变导致菌株性状衰退，另一方面，纯种发酵的风味较为单一，难以满足市场多样化需求。此外，酿酒酵母的外源蛋白表达量较低，难以满足多种工业化的发酵需求。

此时，非酿酒酵母（non-Saccharomyces）在工业发酵领域逐渐受到关注和研究。尽管很多非酿酒酵母被认为是不受欢迎的污染杂菌，但仍然有不少被认为是有益菌种，一方面能降低腐败污染风险、提高发酵效率，另一方面，能合成多种酶将原料中的前体物质转化为风味物质，如增加酒中甘油含量、降低乙酸含量，产生酯类、挥发性酚类等特殊风味物质，能够改善发酵食品和饮料的整体质量和品质，增强风味多样性。库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）便是这样的一种非酿酒酵母。1960 年Kudryavtsev[1]根据其球形的子囊孢子特征最先将该菌种描述为东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis），经过一些列DNA 序列对比实验后，才最终定下P.kudriavzevii的命名。

P.kudriavzevii在自然界中广泛分布，经常在自发发酵中出现，如白酒、葡萄酒、乳制品、酸面团等，但P.kudriavzevii在发酵工业中的作用和地位需要进一步评估。例如，有研究表明，P.kudriavzevii导致了泡菜的腐败，包括异味和质地软化；假丝酵母引起的人类真菌感染中约2 %是由P.kudriavzevii（即Candida krusei）导致。另一方面，人们越来越认识到P.kudriavzevii作为工业发酵过程中的发酵剂的潜力：其独特的风味特征和酶活性使它们非常适合开发新风格酒精饮料；同时它们对低pH 值的耐受性，其有效的新陈代谢以及产生高浓度乙醇的能力引起了生物乙醇研究领域的注意。因此，对P.kudriavzevii的研究是一个热门话题，并且越来越多的研究开始针对特有的P.kudriavzevii的基因组、转录组、代谢组、蛋白质组和表观特征。

在本综述中，我们主要就P.kudriavzevii的现有信息进行了全面概述。在第一部分中，讨论了生物学和遗传多样性以及P.kudriavzevii的分类历史和地位。在第二部分，综述了P.kudriavzevii的遗传特征，以及进化如何塑造该物种的基因组。接下来，我们回顾表型特征，例如风味活性化合物的产生，工业相关条件下的生长模式和微生物安全性方面。在最后一部分，我们讨论了P.kudriavzevii在三个发酵过程中的作用和潜力，即中国白酒、葡萄酒和生物乙醇的生产及其他应用潜力。

1 库德里阿兹威氏毕赤酵母分类历史和地位

P.kudriavzevii最初被Kudryavtsev描述为Issatchenkia orientalis，他认为球形子囊孢子是Issatchenkia属的定义特征之一。Kreger-van Rij 不接受这种分类，并将该物种转移到Pichia属作为P.orientalis。Boidin 等[1]注意到与之前Pichia orientalis的不同，并提出了新名称P.kudriavzevii。Von Arx等[2]重新审视了酵母种属的范围，强调子囊孢子形态作为一个定义的特征，并恢复了Issatchenkia属。因此，Kurtzman等[3]接受了Issatchenkia属，并在该属中增加了现在被分类为P.exigua、P.occidentalis、P.scutulata和P.terricola的物种。然而，对D1/D2LSU rRNA基因序列的分析表明，归类到Issatchenkia属的物种是P.membranifaciens进化枝的成员[3]。多基因分析进一步强调，Issatchenkia属是P.membranifaciens进化枝的成员，并导致它们返回Pichia属。全基因测序结果表明，P.kudriavzevii、C.krusei、I.orientalis和C.glycerinogenes是同一物种不同名字，基因组的DNA 序列同源性为99.6 %[4]。与工业应用相关的出版物通常使用物种名称P.kudriavzevii，I.orientalis或C.glycerinogenes优先于C.krusei，可能是因为在生物技术或食物环境中使用病原体名称会有负面的安全性信号[5]。根据One Fungus One Name 原则，因此应该把P.kudriavzevii作为唯一名称来使用。

2 库德里阿兹威氏毕赤酵母基因组及表观特征

P.kudriavzevii广泛分布于自然界，常发现于各种天然发酵、果实和土壤中，这些生态位存在各种环境压力：低氧、低pH 值、高温、高乙醇浓度等[6]。本节将简要概述P.kudriavzevii基因组以及其表型特征，使其适应这些恶劣的环境，并竞争胜过其他微生物，最后还讨论了其工业化应用的潜在生物安全性。

2.1 基因组

新一代测序技术使全基因组测序成为一项便宜且近乎琐碎的工作，目前已发表了40 多株不同酵母的基因组，其中包括5 株P.kudriavzevii和2 株C.krusei的基因组序列，但很少提供染色体水平的组装或基于转录组的注释。Douglass 等[5]测序P.kudriavzevii的基因组，显示其基因组由5 条染色体组成，10.18～12.94 Mb，其蛋白质编码的基因密集（约4949～7107 个基因），几乎没有重复的DNA；虽然P.kudriavzevii是甲基营养酵母进化枝的成员，但P.kudriavzevii基因组不含有甲醇氧化酶基因（MOX1/AOX1），它们都不能以甲醇作为唯一的碳源生长。另外，P.kudriavzeviiM12 带有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和负责将木糖转化为D-木酮糖的木酮糖激酶，可将木糖转化并进入磷酸戊糖途径以生产乙醇；此外还带有3 个编码植酸酶的基因等，有作为益生菌的潜力。

首次报道描述P.kudriavzevii时，它的每个子囊能够形成一个孢子，但Kurtzman 等[3]后来的研究报道，P.kudriavzevii不会交配或形成孢子。Douglass等[5]测序发现该CBS573 菌株是三倍体，这为其不能形成孢子或至少不能产生具有活性的孢子提供了一种可能的解释。测序研究的32 株P.kudriavzevii中大多数是二倍体，但仍有部分菌株是三倍体。P.kudriavzeviiCBS573 的基因组似乎含有完整的生殖周期基因库，包括信息素基因（MFa，MFα）和MAPK 激酶途径中控制交配的大多数同源基因。对三倍体分离株的可能解释是，例如MATa/α二倍体丧失杂合性（大多数菌株均含有MATa 和MATα基因，但有的仅含有MATa 或MATα）而变成MATα/α，然后与MATa 单倍体孢子交配以形成MATa/α/α三倍体。

2.2 生理特性

P.kudriavzevii在含5%麦芽汁琼脂培养基上培养3 d 后，菌落呈丁香和淡奶油色；Dalmau 平板法培养7 d 后，在盖玻片下显示出丰富且适度分枝的假菌丝。尽管P.kudriavzevii和酿酒酵母的亲缘关系较远，但它们都具有一些共同特征，例如都属于兼性厌氧菌，具有多重耐受性，这使它们能够在许多酒精发酵环境中具备竞争优势。

氧气。研究表明[7]，P.kudriavzevii是好氧酵母，在溶氧充足（溶氧饱和度＞30%）的环境中，其呼吸作用占主导位置，此时生长迅速且没有生成乙醇，这表明P.kudriavzevii是Crabtree阴性。实际发酵环境很难保证溶氧充足，特别是在厌氧发酵环境，P.kudriavzevii的生长速率和底物利用率都会比有氧条件低，此时会生成乙醇、乳酸、甘油等产物，适当增加发酵体系中的溶氧能够提高P.kudriavzevii的发酵速率和乙醇产量。

温度。利用生物质发酵前需要加酶进行高温糖化预处理（约50 ℃），耐高温酵母可以边糖化边发酵，缩短发酵时间，还能降低冷却成本和污染风险，特别是在全年气温通常很高的热带国家，因此酵母的耐热性对于发酵生产生物乙醇非常重要[8]。P.kudriavzevii在35～45 ℃条件下，其发酵效率比酿酒酵母更高。据报道，在40 ℃条件下，P.kudriavzeviiRZ8-1 的乙醇产量可达3.38 %（含8.5 %葡萄糖），P.kudriavzeviiDMKU 3-ET15 的乙醇产量可达7.86%（含18%葡萄糖的木薯淀粉水解物）[7]。在高温乙醇发酵过程中，编码热休克蛋白（ssq1 和hsp90），乙醇脱氢酶（adh1，adh2，adh3 和adh4）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（tdh2）的基因被上调，表明这些基因可能在热胁迫下对P.kudriavzeviiRZ8-1 的耐热能力起着至关重要的作用；代谢组学分析发现P.kudriavzevii的耐热性还与不饱和脂肪酸、嘌呤和嘧啶的含量更高有关。

碳源。P.kudriavzevii能够代谢利用多种碳源进行生长，但是利用效率存在较大差异。经研究人员证实P.kudriavzevii对葡萄糖、果糖利用率最高，其次是甘露糖、乙醇和甘油，个别菌株能少量利用半乳糖和木糖；不会代谢麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、纤维二糖、棉子糖或海藻糖、麦芽糖[7，9]。大部分P.kudriavzevii菌株因不含有蔗糖酶而不能利用蔗糖，但是也有报道个别菌株能够利用蔗糖产乙醇，且经过半乳糖预处理的P.kudriavzevii细胞利用蔗糖的速率更快，乙醇产量更高。此外，P.kudriavzevii是Krebs 阳性菌，可以消耗苹果酸和其他三羧酸循环中间体作为唯一的碳源和能源，且不受葡萄糖抑制，该特点使P.kudriavzevii能够在厌氧发酵过程中降解柠檬酸或苹果酸，调节酒体的酸度；而S.cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Schizosaccharomyces pombe等Krebs 阴性菌只能在葡萄糖或其他可同化的碳源存在的前提下才能利用苹果酸[10-11]。

氮源。氮源是影响酵母菌生长和代谢的关键，P.kudriavzevii能够代谢利用有机氮和无机氮进行生长，包括酵母提取物、玉米浆、硫酸铵和磷酸二铵等，但很难利用硝酸盐和尿素[9，12]。Rijswijck等[13]的研究表明，在限制氮源的条件下，P.kudriavzevii的生长模式会发生转变，此时的P.kudriavzevii会形成metafilaments 或假菌丝。尽管假菌丝形成背后的机制及其在细胞代谢中的作用尚不清楚，可能与缺少辅酶有关，也与编码细胞壁蛋白的基因FLO11和酯类物质的形成也有关系，推测认为假菌丝是在营养物质耗尽期间形成，尤其是氮源，假菌丝的形成有助于深入培养基获取营养物质。

2.3 生物安全性

酵母大多都是不具有侵略性和传染性的微生物，但个别酵母可能是机会致病菌。P.kudriavzevii及其无性型假丝酵母（C.krusei）广泛分布于自然界中，也是一种常见的临床分离真菌[5，14-15]。但P.kudriavzevii和C.krusei[11，16]均不被认为是致病菌，被归类为生物安全1 级（BSL-1），被美国FDA 认为是“公认的安全”[5]，同时也被列入国际乳业联合会（IDF）与欧洲食品和饲料文化协会（EFFCA）出版的“MFC 清单”中。然而，最新的研究显示，来源于环境的P.kudriavzevii和来源于临床的C.krusei的表型没有明显差异，且大都具有相似水平的耐药性；甚至整个毕赤酵母属似乎都具有对氟环唑的高耐药性，例如P.fermentans、P.norvegensis和P.cactophila等[5]。

酵母、人类反应和食物之间的联系主要基于饮食观察，当个体的健康和免疫系统较弱时会面临的风险更大，包括癌症、艾滋病以及接受免疫抑制药物、广谱抗生素和放射化疗的患者[17]。人群中这种个体的频率越高，报告酵母感染的报告就越多；此外，越来越多的酵母菌应用于发酵工业，增加了个体暴露于酵母的感染几率。因此，在生物工业中使用P.kudriavzevii可能会对免疫功能较低的工人的健康产生潜在的危害，并可能对消费者造成潜在的危害，这需要引起注意。

3 库德里阿兹威氏毕赤酵母在发酵工业中的作用

经常能在一些传统食品和饮料的发酵过程中分离得到P.kudriavzevii，例如中国白酒、可可豆发酵、葡萄酒、发酵乳等，同时还具有作为益生菌和生物控制剂的潜力[16]；同时，P.kudriavzeviiis在生产生物乙醇、甘油和琥珀酸方面发挥着越来越大的作用。

3.1 中国白酒

大曲作为生产中国白酒的重要糖化剂和发酵剂，Zheng 等[18，20]采用可培养与不可培养相结合的技术方法对清香型白酒发酵剂大曲的微生物多样性进行了研究，明确了P.kudriavzevii是汾酒大曲中常见的酵母菌。随后Li 等[19]研究发酵剂生产过程中微生物的群落结构和组成，同样证实了P.kudriavzevii是清香型白酒大曲中重要的真菌组成，存在于大曲的整个发酵过程，并且对大曲质量的好坏有着至关重要的作用，甚至会对清香型白酒的风味产生重大影响。与此同时，研究表明，在酱香型和浓香型白酒的酿造过程中同样存在大量的P.kudriavzevii，说明了该酵母广泛参与了中国白酒的发酵过程[21-23]。

Wu 等[24]对清香型白酒的重要微量风味成分萜烯化合物进行解析，该结果表明，萜烯化合物是谷物和原料在清香型白酒发酵过程中经S.cerevisiae、P.kudriavzevii和W.anomalus3 种酵母的作用而形成。此外，Deng 等[25]研究表明，P.kudriavzevii具有较强的耐酸作用及降解乳酸的能力，在高乳酸胁迫下，与单一培养的P.kudriavzevii或S.cerevisiae相比，共培养能显著提高了乳酸消耗，恢复S.cerevisiae的乙醇代谢能力。

综上所述，P.kudriavzevii广泛存在于中国白酒的酿造过程，它不仅参与调节酿造微生物的菌群功能；同时，其与酿酒酵母所产的风味物质很相似，但风味物质之间的相对比例却是不同的，最终风味轮廓的差异为开发具有独特风格的白酒提供了更多可能性。

3.2 葡萄酒

近些年，由于全球变暖引发了葡萄成熟过程中酚类成熟度和糖含量之间的时间差，如果葡萄在其酚类成熟度适宜时收获，它们的糖含量会更高，从而导致葡萄酒的乙醇浓度增加[26]。根据消费者的新需求，这种较高的乙醇含量是不符合需要的，因为影响风味复杂性感知[27]，并且其过量消耗对健康和道路安全有害。使用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵，能够降低酒精度，同时提高风味和口感。使用P.kudriavzevii发酵葡萄酒，令人愉快的“水果香”就明显高于使用酿酒酵母发酵的葡萄酒；多种风味物质浓度超过了酿酒酵母发酵的葡萄酒，包括丙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、正戊醇和苯乙醇等，而这些挥发性风味物质浓度与水果香呈正相关[11]。研究表明，Ehrlich 途径或负责酯合成的特定酶（酿酒酵母中的Atf1p，Atf2p）也存在于非酿酒酵母中，其中Ehrlich 途径的酶（如Aro10p）具有广泛的底物特异性，导致形成多种杂醇，即使只有一种氨基酸作为的氮源[28]。

乙酸和甘油是P.kudriavzevii己糖发酵最重要的副产物，其中甘油具有一点的甜味和黏度，当葡萄酒中甘油浓度接近5.2 g/L时，它会使葡萄酒具有圆润的特性，同时还可以平衡酸感，增加口感的复杂性。此外，使用P.kudriavzevii发酵葡萄酒能够降低有机酸的含量，降低酸度，提高挥发性酸含量。

3.3 生物乙醇

生物质的水解产物非常复杂，纤维素大部分水解成葡萄糖，半纤维素被分解成不同的己糖以及戊糖，例如葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和L-阿拉伯糖等；由于水解过程是在高温和高压下，部分己糖和戊糖脱水后被降解为羟甲基糠醛（HMF）和糠醛等。这些副产物对酵母细胞具有毒性，HMF 和糠醛即使在低浓度下也对RNA、DNA、蛋白质和细胞膜具有破坏作用。去除这些副产物的成本非常高，因此，筛选对这些副产物具有耐受性的酵母菌株对提高生物乙醇发酵效益更切合实际。

虽然到目前为止，关于非产酒酵母对糠醛等副产物耐受性的分子基础报道很少，但很多研究已将P.kudriavzevii用于高温发酵生物乙醇。Kwon 等[29]的研究表明，P.kudriavzevii能在5 g/L 糠醛下生长而完全不受抑制，在7 g/L 时才被完全抑制；某些菌株对HMF 耐受限度可以超过7 g/L；同时，P.kudriavzevii还能耐受其他几种水解副产物的抑制，例如可耐受高达8～10 g/L的乙酸，2 g/L的甲酸和1.8～2 g/L的香草醛。此外，P.kudriavzevii还能耐受其他几种生产生物乙醇时的环境胁迫因子。例如，P.kudriavzevii能在高温条件下发酵，在高于35 ℃时发酵效率比酿酒酵母高，甚至可以在高达45℃的条件下发酵[30]；并且可以耐受高达12%～15%（v/v）的乙醇、5%～10%（w/v）的NaCl 和40%～48%（w/v）的葡萄糖[31]，还可以在极低的pH 值条件下生长（低至pH2）[32]。

转录组数据显示，在10%乙醇胁迫下P.kudriavzevii的500多个基因的表达发生了变化，包括海藻糖和麦角甾醇生物合成途径的修饰，以及与应激相关的各种基因的激活。例如热休克蛋白、伴侣蛋白、泛素-蛋白酶体系统的大量表达，这些都与错误折叠蛋白的重新折叠和降解相关；此外，乙醇胁迫似乎诱导了营养饥饿效应，这与细胞摄取营养，假菌丝生长和孢子形成的变化有关。

4 展望

在过去的几十年中，非酿酒酵母在发酵工业中的应用潜力受到越来越多的关注，本文综述了P.kudriavzevii的基因和表型特征信息，以及工业中的一些应用。虽然P.kudriavzevii与酿酒酵母酵母相比，较低的生长速度阻碍了其在短批次发酵中的竞争力，但是它们在特定情况下具有特别应用的潜力，特别是在高温与低pH 值和高乙醇因素相结合的情况下[10]。尽管如此，P.kudriavzevii对这些胁迫条件的耐受性分子机制仍未得到充分研究，针对性的基因组工具和技术非常有限，今后还需操控其遗传信息和代谢途径来充分发挥这种多重耐受酵母的潜力。