红杆铁皮石斛提纯关键技术

陈慧珍,董春玲,王可可,张建宏,黄胜波,唐 杰,熊慧薇,杨国胜,陈祥平,刘建萍

(1.萍乡市农业科学研究所,江西 萍乡 337000；2.萍乡市祥国农业科技发展有限公司,江西 萍乡 337000；3.江西省农业科学院农产品加工研究所,江西 南昌 330045；4.江西农业大学 农学院/江西省作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西 南昌 330045)

1 引言

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)[1]，是兰科石斛属多年生附生型草本植物[2]。以铁皮石斛为原料，可制成中成药、化妆品、保健品、干品及花茶等产品[3]，也是一种药食同源植物，被列为九大仙草之首。在表型性状上，根据铁皮石斛茎秆上紫斑的有无分为红杆和青杆。相关研究表明红杆铁皮石斛在品质上普遍优于青杆铁皮石斛[4]。目前，人工栽培的铁皮石斛种苗基本属于无性繁殖而来，表现多为青秆，而原始的铁皮石斛则多为红秆。因此，多季的无性繁殖使铁皮石斛原有的药性大大降低，丧失了铁皮石斛道地的种性。目前，野生铁皮石斛资源已经逐渐枯竭。在人工栽培过程当中常呈现多种表型性状差异的类型，引起铁皮石斛药材在质量上良莠不齐。铁皮石斛种质居群，按照行内的通俗称谓可分为红皮、青皮、轮条、硬脚4个类型，种质选择红皮居群可从源头上确保铁皮石斛药材的优良品质[5]。

为更好地保护和开发铁皮石斛野生资源，萍乡市农业科学研究所与萍乡市祥国农业科技发展有限公司合作，利用原始野生种质资源人工杂交授粉后成熟蒴果的种子进行萌发组培繁育成种苗，获得萌芽率高、病虫害少、秆粗、胶质多、多糖、生物碱含量高、品相好等纯系红杆铁皮石斛，延续了野生铁皮石斛的诸多品质及道地药性。培育的种苗通过“科企+基地+农户(贫困户)”的模式，2016～2018年在江西省萍乡市安源区五陂镇大田村和莲花县高洲乡黄沙村共进行大棚种植约1 hm2，带动两地66户贫困户脱贫。

2 主要特征特性

铁皮石斛为常异花授粉植物[6,7]，果为蒴果，种子如粉尘状、小而多，不容易天然繁殖。此研究的红杆铁皮石斛茎直立，丛生，不分枝，圆柱形，具多节，茎节为白色，鲜茎杆颜色为暗红色；叶二列，长圆状披针形，纸质，基部下延为报茎的鞘，叶片以绿色为基色，边缘及中肋呈淡紫色；总状花序生于无叶茎的中上部，具花2～5朵，花瓣浅黄白色，卵状披针形；花苞片干膜质，白色，卵形。唇盘在中部以上有1个紫红色斑块；蕊柱呈黄绿色。其喜温凉，怕寒又怕高温，属于气生根，为半阴生植物等特性，对种植方式要求比较严格，以半自养半异养的营养方式生长发育[8]。铁皮石斛的生长显著受环境影响[9]。江西萍乡属亚热带湿润季风气候区，位于北纬26°57′～28°01′、东经113°35′～114°17′。萍乡初花期一般在4月底5月初，单株花期为15 d左右，种群花期60～90 d，鲜条最佳采收期为每年2～4月底暨开花前期。经2016～2020年观察，在该地区仿野生露天种植的枣树上附生的红杆铁皮石斛能度过当地短暂零下4 ℃与持续3 d的39 ℃的极端天气而存活。

3 组织培养技术要点

3.1 组培材料选择

铁皮石斛是用纯系种间盛花期的花粉杂交后成熟蒴果中的种子作为组培外植体，进行组织培养快繁及大棚移栽种植。2011年，用选自安徽省黄山市的齐云山和大别山脉的天柱山野生铁皮石斛原种植株，筛选出3年生以上生长健壮、萌枝力强和枝条红杆率为100%的原种植株作为杂交亲本备用。在原种植株开花期间，以天柱山野生铁皮石斛作父本，以齐云山野生铁皮石斛作为母本，进行人工杂交授粉，待异花授粉的原种植株蒴果成熟期，收获外观紫红色，着色均匀，形态饱满且未开裂的果实，在通风橱无菌操作条件下，将果实切口，将种子播于萌发培养基质，经萌发培养发芽生长出幼苗，再经生根培养获得实生苗[10]，一般持续种内杂交6代以上，可达到性状基本稳定，种性纯正，如此经历多年杂交筛选研究培育获得红杆铁皮石斛。待原种植株蒴果成熟时，采收外观紫红色，且着色均匀，端正饱满尚未开裂的果实，经无菌操作处理后，在通风橱无菌条件，将果实切口，将果实中的种子播撒于萌发培养基上发芽生长幼苗，幼苗再经生根培养后，获得实生苗进行栽培。再在上述栽培的实生苗植株中选择生长健壮、萌枝力强和红杆率达100%的实生苗植株进行异花授粉，再待蒴果成熟时，采收外观紫红色且着色均匀，端正饱满尚未开裂的果实作为种子，留种子作为生产备用。

3.2 组培方法

萌发培养基主要有1/2MS、萘乙酸(NAA)、活性炭等。培养基用蔗糖、琼脂、肌醇、硫酸镁、硼酸、甘氨酸及其他微量元素等按一定比列配制。生根培养基主要成分为MS、香蕉汁、活性炭。通过无菌操作，将上述留作生产备用的种子，播撒于萌发培养基上发芽生长，经过20～30 d完成萌发培养。将萌发培养基生长出的原球茎接种于生根培养基上进行幼苗生根培养，经过30～40 d完成幼苗生根培养，再进行炼苗移栽。组培期间使用LED光谱节能灯提供种苗光合作用所需光源。光照强度600～700Lx，时长为16 h/d，培养温度为(21±2)℃。

4 炼苗管理

炼苗是种苗成活的关键因素。当石斛组培苗长至苗高5 cm左右、5片以上叶片适宜出瓶炼苗。移栽前将培养种苗瓶置于大棚内不开盖常温炼苗3～5 d。再将瓶塞拧开常温放置2～3 d，出瓶前使种苗逐渐适应外界栽培的气候条件，提高移栽成活率。出瓶时，用镊子小心夹出种苗，尽量减少创伤。用甲基托布津4000～6000倍稀释液洗净残留的琼脂培养基质，起到杀菌作用。室内阴凉通风处，用穴盘摊晾炼苗2～5 d，气温较高时晾2～3 d，气温(低于18 ℃)较低时晾3～5 d，至根部水分晾干，根呈白净。

5 移植

炼苗后及时定植移栽。使用50 cm×50 cm×6 cm规格的穴盘栽培。定植基质采用100%椰子壳砖，或者50%椰子壳砖与50%松树皮以1∶1混合进行高温消毒，脱脂脱盐，自然晾干、堆沤后消毒再使用。铁皮石斛驯化苗按丛为单位栽3～5株为一丛，按6 cm×6 cm丛行距种植。将苗根系自然摊开，将基质轻轻填盖根须，露出基部，不宜深植。过度深植可能造成根部腐烂。幼苗定植后，用50%多菌灵6000倍稀释液喷施杀菌消毒。

5.1 棚内穴盘种植

红杆铁皮石斛大棚栽培技术主要包括选址、大棚设计、苗床设计、基质选择、定植方式以及营养肥配制。根据其生长习性选地，一般选择空气湿度较大、流通良好，水源充足洁净，远离明显污染源的地域。大棚形式根据覆盖材料一般使用拱形，遮阳采取内外遮阳结合，外遮阳为光照控制，用黑塑编织幕。内遮阳主要考虑保温，一般采用薄膜或无纺布。棚内摆放穴盘的铁架，高1 m左右，宽2 m左右，长度可采用4～5 m，苗床间过道间距约0.5 m。穴盘距离地面1 m，可隔离地表土传病害。

5.2 仿野生种植

石斛仿野生种植可采植株健壮的活立木作为附生载体[11]。附生栽培的树种常选择树皮较粗厚且有纵横裂沟、树干粗大、树冠茂盛、没有特殊异味的常绿林木[12,13]。因松树会分泌松脂，树种避免用松树，同时避免林内种植松树。目前，铁皮石斛仿野生种植的树种有龙眼树、椿树、栗树、杜仲、厚朴、枫香、青杠、核桃等[11,13,14]。在萍乡市安源区五陂镇科研基地，采用生长多年的活枣树为附生树种，棚外枣树在自然光温条件下种植。对树适时修剪，使林内林下通风透气，保持适宜光源。树体附件安装软管自动喷雾系统。在当地每年2～4月份或9～11月份，将温室棚内种植1年至1年半的种苗根部用棉线绳或棕片捆绑附生在枣树树枝干上，用水浸泡10～15 min后的水苔作保湿材料。在种苗的根部用水苔等基质覆盖，再用棉线或棕片缠绕几圈绑牢固定，以此固定铁皮石斛的须根于所植附主树的树干或树枝上，确保种苗不掉落即可。移栽时根系自然摊开在枝干上，植株茎叶朝上生长。以丛为单位栽植，每丛种植5～8株标准壮苗。最好离地面高40 cm以上处开始种植，上下丛约30 cm间距。不一定要有行距，每丛横向不相互遮蔽为宜，水平丛间距约20 cm。植后看天气、湿度适时淋水。注意拔除种植地的林下杂草。

6 苗期管理

日常管理包括施肥、喷水、通风以及病虫害防治等。做好浇水、追肥、整枝等田间管理。夏季高温天气适度喷雾，至基质喷透，保持棚内湿度为75%～85%[15,16]。其它季节萍乡天气较潮湿，鲜少喷水。适时打开排气扇，透气通风降低湿度。众多研究表明，石斛最适宜生长温度25℃左右[16,17]。当棚内气温超过30 ℃，开启湿帘墙负压通风降温模式。当地极少有极端低温天气。必要时可使用增温块。适量施用安全高效肥。使用花无缺20-20-20+TE粉剂肥料、益微元有机肥料(颗粒型)来补充必需元素促进生长。当叶片缺N泛黄时，可施用含氨基酸水溶肥料。以防重于治为原则，病虫害防治以预防为主，结合物理、生物防治，尽量避免农药使用[18]。防治蜗牛危害，可采用人工拾捡方法和施用茶皂素或茶粕[19]。茶皂素也对黑斑病、石斛炭疽病等病害有一定的防治作用。

7 部分结果差异比较

多糖是石斛属植物的主要活性成分[20]。葡萄糖和甘露糖是铁皮石斛茎多糖的主要组成[21]。2018年5月采收安源区五陂镇基地种植2年半的红杆铁皮石斛鲜茎，按《中国药典》2015年版一部方法检验，按干燥品计算，结果为以无水葡萄糖(C6H12O6)计含多糖42.0%，含甘露糖(C6H12O6)20.3%。通过对红杆与青杆铁皮石斛鲜食感官评价，发现红杆黏度明显高于青杆。姜波等对不同品系铁皮石斛，在不同生长期采摘进行多糖含量检测，结果显示多糖含量最高达到30.24%[22]。陈丽璇等对人工栽培的红杆铁皮石斛研究结果发现，其鲜条多糖含量在氨基酸硒肥浓度为900倍液时最高为35.213%[23]。可见，本研究培育的红杆铁皮石斛多糖含量相对较高，品质优。

2019年10月，随机采取安源区五陂镇、莲花县高洲乡两地种植的同批次组培及移栽且没有施用硒、锌肥的红杆铁皮石斛样品，用GB5009.93-2017、GB5009.14-2017检验方法分别检测硒、锌含量。采自两地的灌溉水源用GB/T5750.6-2006检验方法进行硒、锌含量检测。安源区五陂镇采摘的红杆铁皮石斛含硒量为6.40×10-3mg/kg，含锌量为5.6 mg/kg；水样含硒量为<1.14×10-4mg/L，含锌量为<0.01 mg/L。莲花县高洲乡采摘的红杆铁皮石斛含硒量为7.14×10-3mg/kg，含锌量为50 mg/kg；水样含硒量<1.14×10-4mg/L，含锌量为<0.01 mg/L。结果表明，此品系红杆铁皮石斛对硒、锌有较好的富集作用，可考虑施用适宜浓度的氨基酸硒肥来提高鲜条硒和多糖含量[23]。

用直尺和游标尺分别测量茎长、从上到下第3节茎粗[24]。测量每丛铁皮石斛的鲜茎长，随机测取10丛正常生长的，取平均值为其茎长。棚内穴盘种植2年的红杆铁皮石斛茎长为15.6 cm，茎粗为3.18 mm，相同栽培情况下，棚内穴盘种植2年的绿杆铁皮石斛茎长为23.4 cm，茎粗为3.4 mm。在棚内穴盘种植1年至1年半的红杆铁皮石斛，2018年春季移栽到户外进行枣树仿野生种植，在枣树上生长约3年的茎长为26.4 cm，茎粗约为2.9 mm。棚内穴盘种植1年至1年半的红杆铁皮石斛，移栽到盆栽内生长约3年的茎长为33.4 cm，茎粗约为3.22 mm。

8 结论与展望

实践表明，铁皮石斛通过以上方法组织培养，进行提纯复壮，红杆率能达到95%以上，并适宜在江西萍乡规模人工种植，而且品质能达到有关行内要求。当铁皮石斛叶鞘长满至顶端时，其保健品质更好。五陂镇基地的红杆铁皮石斛产品依据GB/T19630-2019有机产品生产、加工、标识与管理体系要求，已通过有机产品认证。萍乡的大部分地域自然气候条件可发展铁皮石斛棚内及林下种植。通过棚内穴盘、林下2种栽培模式对比发现，林下活树仿野生附生种植模式较棚内穴盘种植方式成活率高，而棚内穴盘种植单位面积收获的经济效益较高。林下活树仿野生附生种植的铁皮石斛外观、感官等品质较棚内更佳，病虫害相对较少。这与现有研究结果仿野生种植的品质综合评价高于设施种植相一致[25]。