微型月季抗逆性基因表达与微卫星序列连锁分析

王建婷 刘广达 吴归 安天琪 李娜

摘要 使用转录组学的方法研究水杨酸和茉莉酸甲酯处理微型月季的基因表达，发现2种处理的植物-病原菌相互关系通路均有数量较多的差异表达基因，并对该通路中差异表达基因连锁的微卫星序列进行了统计。该研究有助于进一步理解水杨酸和茉莉酸甲酯提升微型月季抗逆性的机理。筛选与抗逆基因连锁的微卫星序列可为今后的育种研究提供帮助。

关键词 微型月季;微卫星序列;水杨酸;茉莉酸甲酯

中图分类号 S 943.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）21-0124-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Expression of Stress Resistance Genes and Linkage Analysis of Microsatellite Sequences in Miniature Rose

WANG Jian-ting， LIU Guang-da， WU Gui et al

（ School of Pharmacy， Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science Technology， Baotou， Inner Mongolia 014040）

Abstract In this study， we used transcriptomics methods to study the gene expression of miniature rose treated with salicylic acid and methyl jasmonate， it was found that there were a number of differentially expressed genes in the plant-pathogen interaction pathway after the two treatments， and the microsatellite sequences linked to the differentially expressed genes in the pathway were statistically analyzed. This study will help to further understand the mechanism of salicylic acid and methyl jasmonate improving the stress resistance of miniature rose. Screening microsatellite sequences linked to stress resistance genes will provide help for future breeding research.

Key words Miniature rose;Microsatellite sequences;Salicylic acid;Methyl jasmonate

基金項目  自治区级大学生创新创业训练计划项目（201910127017）。

作者简介 王建婷（1998—），女，四川宜宾人，从事药用植物研究。*通信作者，讲师，博士，从事药用植物生物技术研究。

收稿日期 2021-05-27

微型月季（Rosa hybrid minima）为蔷薇科植物，由于具有花色奇异、全年开放和适于盆栽等特点[1]，深受消费者喜爱，具有较高的市场价值。生物和非生物胁迫是微型月季生产中的重要问题。在栽培过程中，微型月季会受到多种病原微生物的生物胁迫[2]。在运输过程中，微型月季易受到黑暗、缺水和震动等非生物胁迫[3]。提升微型月季的抗逆性对其商品化生产有着重要作用。水杨酸和茉莉酸甲酯是植物体内普遍存在的抗性信号分子，可以对生物和非生物胁迫产生响应，提升植物的抗性[4-6]。外施水杨酸和茉莉酸甲酯可以促进多种植物抗逆性[7]。

微卫星序列又称简单重复序列（simple sequence repeats，SSR），是存在于大部分真核生物基因组中的短串重复序列[8]，SSR分子标记技术在植物育种和近缘植物亲缘关系研究方面有着广泛的应用[9]。随着转录组技术的发展，许多植物开展了针对转录组中SSR的研究[10-11]。相比于基因组中的SSR，转录组中的SSR存在于发生转录的基因序列中，这些SSR可能与功能基因直接相关，从而与性状有更好的相关性[12-13]。

该研究以水杨酸和茉莉酸甲酯处理微型月季，利用转录组学的方法研究处理后差异表达基因富集程度较高的代谢通路，分析与抗逆性相关的代谢通路，探讨外施水杨酸和茉莉酸甲酯对微型月季抗逆性作用机制的差异，寻找与主要抗逆性代谢通路中基因相连锁的SSR序列，为提升微型月季抗逆性的育种工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择盆栽微型月季（Rosa hybrid minima），采取叶面喷施的方法，水杨酸处理喷施100 mL 1 mmol/L水杨酸，茉莉酸甲酯处理喷施100 mL 1 mmol/L茉莉酸甲酯，对照喷施100 mL蒸馏水（CK）。处理24 h后，采集微型月季的花瓣。

1.2 方法

采集花瓣后液氮速冻，使用Invitrogen Trizol试剂提取总RNA，经质检后送联川生物进行文库的构建和高通量测序，测序采用Illumina Hiseq 4000平台，测序读长为双端2×150 bp。

1.3 数据处理

測序产生的原始数据（raw data）去除接头序列，过滤掉不合格序列后得到有效数据（clean data）。采取混合组装的策略，归一化得到Unigene，使用DIAMOND软件[14]对组装的Unigenes进行注释。使用Salmon软件[15]计算Unigenes的表达水平，使用R软件包edge R筛选差异表达Unigenes[16]，使用perl脚本进行KEGG富集分析，设置差异表达的标准为│log2（fold change）│>1（P≤0.05）。富集因子（rich factor）为位于该KEGG通路的差异基因数/位于该KEGG通路的总基因数。对显著差异的基因占某个通路所有基因数的比例和所有通路的总基因数目中的差异基因比例进行检验，得出富集分析中通路的P值。SSR的鉴定使用MISA软件（http：∥pgrc.ikp-gatersleben.de/misa/）对Unigenes进行分析。

2 结果与分析

2.1 水杨酸对微型月季基因转录的影响

水杨酸处理组与CK相比，在差异表达基因富集程度最高的20条KEGG代谢通路中，异黄酮生物合成通路（isoflavonoid biosynthesis）的富集因子值最大，为0.3 差异表达Unigene基因数为8，通路的P值为3.9×10-4。植物-病原菌相互关系（plant-pathogen interaction）通路差异表达Unigene基因数最多，为13 富集因子为0.10，通路的P值为1.4×10-3（图1）。

2.2 茉莉酸甲酯对微型月季基因转录的影响

茉莉酸甲酯处理组与对照相比，在差异表达基因富集程度最高的20条代谢通路中，异黄酮生物合成（isoflavonoid biosynthesis）通路的富集因子值最大，为0.3 差异表达Unigene基因数为8，通路的P值为2.2×10-6。植物-病原菌相互关系（plant-pathogen interaction）通路差异表达Unigene基因的数量最多，为8 富集因子为0.06，通路的P值为9.2×10-6（图2）。

2.3 抗逆性相关代谢通路基因表达分析

将差异表达的Unigene在KEGG数据库中进行注释，水杨酸处理注释到27个KO条目中，注释到108个基因（表1）。茉莉酸甲酯处理注释到24个KO条目中，注释到64个基因（表2），其中有3个KO条目未注释到基因。

2.4 植物-病原菌相互关系通路差异表达基因与微卫星序列连锁分析

与CK相比，水杨酸处理和茉莉酸甲酯处理后植物-病原菌相互关系通路中显著差异表达的基因数均为最多，且与抗逆性有着紧密的联系，有利于发掘抗逆性相关的SSR。设置连锁的条件为KEGG注释基因与SSR存在于同一Unigene中，进行统计并记录基因名与具体SSR序列（表3）。水杨酸处理与CK相比，植物-病原菌相互关系通路中有134个Unigene数量差异显著，注释到108个基因，其中有26个基因与SSR序列连锁。茉莉酸甲酯处理与CK相比，植物-病原菌相互关系通路中有82个Unigene数量差异显著，注释到64个基因，其中有15个基因与SSR序列连锁。WRKY24、NQR、DREB3和PBL5 4个基因在水杨酸和茉莉酸甲酯处理下均与SSR存在连锁关系。WRKY65、MYB108、PDPK2、WNK5、At2g26730、CRCK2、WRKY53、WRKY48和WRKY24基因与2个SSR连锁。WRKY22基因与3个SSR连锁。

3 讨论

在植物应对生物胁迫时，植物体内水杨酸、茉莉酸和乙烯通过影响各种信号通路相互作用提升抗性;而在应对非生物胁迫时，脱落酸调节的信号通路起到重要作用。在提升植物抗逆性过程中，这2类信号通路间有着复杂的相互影响，整体上处于拮抗关系[17]。异黄酮类物质有助于提升植物的生物抗性，如大豆异黄酮可以抵抗植物病原微生物和食草性昆虫，诱导根瘤菌结瘤以利于植物抵御逆境[18]。在该试验中，水杨酸和茉莉酸甲酯处理后，异黄酮生物合成通路的富集因子值均为最大，异黄酮生物合成通路中的基因差异表达可能有助于特定种类异黄酮的合成，从而提升植物的抗性。水杨酸处理后，与CK相比，植物-病原菌相互关系、淀粉和蔗糖代谢和植物激素信号转导通路差异表达基因数量较多。而茉莉酸甲酯处理后，仅植物-病原菌相互关系通路差异表达基因的数量较多，且2种处理后植物-病原菌相互关系通路的P值存在差异，说明2种诱导子的作用机制存在差异。

水杨酸和茉莉酸甲酯均可以通过植物-病原菌相互关系通路提升植物抗性，尤其是提升抵抗病原菌的能力[19]，也可以产生系统性获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。

SAR可以长效提升植物抗性和缓解植物受到的非生物胁迫[ 17，20]。在该研究中，与CK相比，水杨酸处理组和茉莉酸甲酯处理组中植物-病原菌相互关系通路中显著差异表达的基因数均为最多，说明该通路对微型月季的抗逆性有着重要作用。在差异表达基因与微卫星序列连锁分析中，有一定数量的SSR与植物-病原菌相互关系通路中的差异表达基因相连锁，为开发抗逆性相关代谢通路的分子标记提供了丰富的信息位点。

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