奶牛乳腺上皮细胞来源外泌体中bta-miR-126-5p 靶基因及调控功能的生物信息学分析

许浩天，连帅，2，武瑞，2，王建发，2

1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2. 黑龙江省牛病防制重点实验室，黑龙江大庆 163319

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌内毒素，为其细胞壁特有的结构。核心多糖、O-特异性多糖链和类脂A 是其组成成分［1］。用LPS 处理乳腺上皮细胞后，可诱导细胞产生一定的炎症反应，分泌相关炎性因子。有研究发现［2］，LPS 处理奶牛乳腺上皮细胞后，白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活性显著增加；另一项研究表明［3］，LPS 处理奶牛乳腺上皮细胞后，肝脏X 受体α（liver X receptor-α，LXRα）以及核转录因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）的相关蛋白表达水平升高。LPS 同样促使奶牛乳腺上皮细胞内部的物质和能量代谢发生显著改变。有研究对乳腺上皮细胞内部脂代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢通路发生甲基化的基因数量进行统计，发现甲基化基因数量随着LPS 浓度的递增呈先增加后减少的趋势［4］。

经LPS 处理后，奶牛乳腺上皮细胞的相关代谢活动发生显著变化，同样可能产生外泌体进行细胞间传递，抵抗LPS 对细胞的不良影响。外泌体是细胞内部的多泡体（multivesicularbody，MVB）与细胞膜融合后排除胞外的、具有一定生物学功能的直径为40 ～200 nm 的小囊泡。外泌体内部存在的主要物质是核酸、蛋白质和脂质。研究发现，外泌体广泛分布于生物体各种体液，如乳汁、血液、尿液、汗液以及唾液等［5-9］，是细胞间信息传递的重要载体。MicroRNA（miRNA）是一类在基因转录后通过对靶mRNA 的翻译抑制和降解，对基因表达起负调控作用的长度为18 ～25 个核苷酸的非编码RNA 分子。在目前的研究中，外泌体miRNA 被认为是一种重要的信号分子，能够在一定程度上反应细胞、组织、器官的活动状态［10-14］。我们在前期工作中提取了奶牛乳腺上皮细胞来源外泌体，并对其进行miRNA 的测序，结果表明，bta-miR-126-5p 在经LPS 处理的奶牛乳腺上皮细胞外泌体中表达量具有显著差异，并呈降低趋势。bta-miR-126-5p 属于bta-miR-126 家族成员，其成熟序列组成为5'-cauuauuacuuuugguacgcg-3'，长度为21 nt。本研究利用生物信息学分析技术，预测外泌体bta-miR-126-5p 的候选靶基因，并对候选靶基因进行蛋白质互作分析、GO 和KEGG 富集分析，为验证外泌体bta-miR-126-5p 在奶牛体内可能发挥的重要调控作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1. 1 bta-miR-126-5p序列保守性分析 在miRBase（www.mirbase.org）数据库中将miR-126-5p 在不同物种中的成熟序列进行对比，分析其在不同物种间的保守性。

1. 2 bta-miR-126-5p 靶基因预测及筛选 使用Targetscan（http：／／www.targetscan.org ／vert_72 ／）和miRWalk（http：／ ／ mirwalk.umm.uni-heidelberg.de ／）在线分析系统预测bta-miR-126-5p 的靶基因，取2个分析系统预测结果的交集作为后续分析对象。

1. 3 bta-miR-126-5p 候选靶基因的GO 富集、蛋白质互作、KEGG 富集分析 利用DAVID（https：／ ／ david.ncifcrf.gov ／）在线分析系统对靶基因进行GO 富集分析；利用STRING（https：／ ／ string-db.org ／）在线分析系统对候选靶基因进行蛋白质互作分析；利用KEGG 在线分析系统（https：／ ／ www.kegg.jp ／）进行KEGG 通路注释分析，并利用相关生物信息软件进行KEGG 富集分析。

2 结 果

2. 1 外泌体miRNA 部分测序结果 外泌体miRNA部分测序结果见表1。

表1 外泌体miRNA 部分测序结果Tab. 1 Partial sequencing results of exosomal miRNA

2. 2 bta-miR-126-5p 序列保守性 bta-miR-126-5p成熟区序列在不同物种间高度保守，牛、马、狗、人的miR-126-5p 的碱基序列完全一致。bta-miR-126-5p与山羊的miR-126-5p 相比，3'端仅多1 个C 碱基，只有mml-miR-126、mmu-miR-126b-5p 与bta-miR-126-5p 在碱基构成上存在显著差异，见表2。

表2 miR-126-5p 成熟区序列在不同物种间的保守性分析Tab. 2 Conservation of sequence of mature region of miR-126-5p in different species

2. 3 bta-miR-126-5p 靶基因预测及筛选 miRWalk在线预分析系统共获得663 个候选靶基因；Targetscan 在线分析系统共获得4 248 个候选靶基因。203 个候选靶基因在2 个预测结果中存在交集，可作为后续进一步研究的对象，见图1。

图1 bta-miR-126-5p 靶基因预测结果Fig. 1 Prediction of target genes of bta-miR-126-5p

2. 4 bta-miR-126-5p 候选靶基因的GO 富集、蛋白质互作、KEGG 富集分析结果

2. 4. 1 GO 富集分析 bta-miR-126-5p 候选靶基因主要在核质、胞浆、高尔基体等内部发挥生物学功能，主要参与金属离子结合（尤其是锌离子结合）以及ATP 结合等细胞内部分子功能过程，见图2。

图2 bta-miR-126-5p 的候选靶基因GO 富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of candidate target genes of bta-miR-126-5p

2. 4. 2 蛋白质互作分析 在203 个候选靶基因中，有125 个候选靶基因所编码的蛋白质存在互作关系。与其他蛋白质存在较多互作关系的基因有遗传多态性鸟苷酸合成酶基因（guanosine monophosphate synthetase，GMPS）、锌指蛋白638 基因（zinc finger protein 638，ZNF638）、RNA 剪接因子3B 第1 亚单位基因（splicing factor 3B sub-unit 1，SF3B1）、Cullin 相关及Nedd 解离蛋白1 基因（Cullin-associated and Neddylation-dissociated protein1，CAND1）、铜代谢基因MURR1 结构域10 基因（COMM domain containing 10，COMMD10）等，其中ZNF638 与脂代谢调控密切相关，COMMD10 与炎症反应密切相关，见图3。

图3 bta-miR-126-5p 的候选靶基因蛋白质互作分析Fig. 3 Interaction of candidate target gene proteins of btamiR-126-5p

2. 4. 3 KEGG 富集分析 将bta-miR-126-5p 候选靶基因KEGG 通路富集分析结果可视化，发现富集于嘌呤代谢、丙酸盐代谢、磷酸肌醇代谢信号通路的靶基因数目较多。在富集的24 条通路中，有3 条通路与脂肪酸代谢密切相关，分别为脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis）、脂肪酸伸长（fatty acid elongation）、脂肪酸降解（fatty acid degradation），富集于3 条通路的靶基因为酰基辅酶A 合成酶长链家族成员6（long-chain-fatty-acid-CoA ligase 6，ACSL6）和超长链脂肪酸延伸酶6（elongation of very long chain fattyacids protein 6，ELOVL6），见图4。

图4 bta-miR-126-5p 的候选靶基因KEGG 富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of candidate target genes of bta-miR-126-5p

3 讨 论

目前，仅有1 篇文章报道bta-miR-126-5p 可能通过直接靶向JNK 相互作用蛋白-2（JNK-interacting protein 2，JIP-2）调控水飞蓟病毒感染的巨噬细胞毒力作用［15］，关于bta-miR-126-5p 在奶牛体内的调控作用未见相关报道。

LPS 作为革兰阴性细菌的内毒素，用其处理奶牛乳腺上皮细胞，必然会对细胞的代谢活动产生一定影响，也会在一定程度上诱导细胞产生炎症反应。经LPS 处理的奶牛乳腺上皮细胞和正常的奶牛乳腺上皮细胞所分泌的外泌体组分同样可能存在差异。因此，利用测序技术筛选奶牛乳腺上皮细胞来源外泌体中差异miRNA 后，发现bta-miR-126-5p 在LPS处理细胞后所产生的外泌体中表达量存在显著差异，且呈下调的趋势。miRNA 是对基因表达起到负调控作用的小RNA 分子，bta-miR-126-5p 的下调提示其可能具有抑制某些物质代谢或促进细胞产生炎症反应的功能。

bta-miR-126-5p 的候选靶基因蛋白质互作分析中，COMMD10、ZNF638 基因与其他基因之间存在较多蛋白质互作关系，提示其可能在奶牛体内具有重要的生物学功能。

COMMD10 在LPS 诱导的全身炎症模型中可抑制Ly6Chi 单核细胞典型和非典型炎症小体活性［16］。在另一项研究中，COMMD10 基因缺陷的枯否细胞（Kupffer cells，KCs）对金黄色葡萄球菌所致感染的清除能力降低。金黄色葡萄球菌感染机体后，COMMD10缺陷型巨噬细胞中转录因子EB 的激活被抑制，导致溶酶体生物活性下降；COMMD10 缺陷型巨噬细胞中吞噬溶酶体的发育和生物功能同样在在金黄色葡萄球菌感染后被抑制。COMMD ／ CCDC22 ／ CCDC93 复合物的表达与吞噬溶酶体成熟有关，细胞中COMMD10 被抑制后，这些复合物的数量随之减少［17］。ZNF638 基因编码的蛋白在成熟的产热脂肪细胞和组织中选择性表达，可通过CREB 信号通路调节促进产热的诱导反应途径［18］。ZNF638 在脂肪细胞分化早期被诱导表达；在体外细胞实验中，ZNF638 异位表达可促进脂肪形成，敲除ZNF638 基因可抑制脂肪细胞分化并降低脂肪细胞特异性基因的表达。进一步研究表明，ZNF638 调控过氧化物酶体增殖激活受体的表达来影响脂肪的形成［19］。

在KEGG 信号通路富集分析中，与脂肪酸代谢相关的信号通路相比于其他信号通路的数量明显较多，富集到脂肪酸代谢通路的靶基因是ACSL6 和ELOVL6 基因。牛乳中的主要营养成分是乳脂和乳蛋白，二者在牛乳中含量的高低直接决定牛乳的品质，而奶牛体内脂肪酸代谢途径直接影响乳脂的合成。

在对啮齿动物和人类的研究中发现，ACSL6 促进酰基辅酶A 合成脂质，下调ACSL6 基因可促进细胞内部线粒体呼吸功能和脂质氧化过程［20］。有研究表明，与对照组细胞相比，转染ACSL6 siRNA 的细胞内部三酰基甘油积累减少，细胞内的游离脂肪酸含量增加。进一步研究发现，ACSL6 可激活并促进脂肪酸的合成代谢途径［21］。在另一项研究中，研究者构建了高脂饮食和低脂饮食小鼠模型，在小鼠腓肠肌中测定ACSL6 的蛋白丰度和mRNA 表达量，结果表明，骨骼肌中ACSL6 表达量的增加可促进高脂饮食小鼠细胞内的脂肪存储［22］。ACSL6在分化的精子细胞中高表达。在ACSL6 基因敲除小鼠精子细胞中，具有长链多不饱和脂肪酸的磷脂含量减少，精子释放出现延迟，分化的精子细胞凋亡。研究结果表明，ACSL6 有助于正常的精子发生过程，可调节精子细胞膜上磷脂的长链多不饱和脂肪酸的组成［23］。

研究者构建了敲除ELOVL6 基因的斑马鱼模型，与野生型斑马鱼相比，敲除ELOVL6 基因的斑马鱼全身脂质含量显著提高。对斑马鱼的肝脏进行转录组、蛋白质组和磷蛋白质组分析发现，敲除ELOVL6基因的斑马鱼脂质代谢和糖代谢异常主要与脂肪酸降解和生物合成、糖酵解／ 糖异生及PPAR 信号通路有关［24］。在牛脂肪细胞中过表达ELOVL6 基因，细胞中短链脂肪酸比例减少、长链脂肪酸比例增加，提示ELOVL6 基因可影响牛脂肪细胞的脂肪酸组成［25］。鸡体内的miR-221-5p 可直接靶向ELOVL6 基因，影响肝脏甘油三酯和总胆固醇含量［26］。在另一项研究中，过表达ELOVL6 显著上调了过氧化物酶体增殖因子激活受体的表达，但抑制了脂肪酸结合蛋白4的表达［27］。在山羊乳腺上皮细胞中过表达或敲除ELOVL6 基因，某些长链脂肪酸的含量会发生显著变化，突出了ELOVL6 在反刍动物乳腺细胞中对长链脂肪延伸合成的重要调控作用［28］。

综上所述，bta-miR-126-5p 可能通过调控COMMD10、ZNF638、ACSL6、ELOVL6 等候选靶基因，参与脂肪酸代谢等信号通路，进而调控与奶牛体内相关的免疫反应、物质能量代谢。对bta-miR-126-5p相关生物信息学的分析，将有利于对其在奶牛体内调控机制的探索，扩展奶牛乳腺上皮细胞来源外泌体miRNA 的功能研究。