去甲斑蝥素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡和炎症因子释放的影响和机制

杨 洋， 刘佳佳， 薛建华， 虞俊波

(南通大学附属医院急诊外科，江苏 南通 226001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)属于慢性自身免疫疾病，其以骨侵蚀和慢性滑膜炎为主要病理特征，临床上表现为小关节畸形、肿胀、疼痛，严重者可导致残疾[1]。滑膜成纤维细胞是RA发生的核心细胞，其与正常的滑膜成纤维细胞比较，具有过度增殖、凋亡减少以及分泌大量的炎症因子等特点[2]。去甲斑蝥素属于斑蝥素的衍生物，其是由呋喃和马来酸酐按照Diel-Alder加成反应而合成的，去甲斑蝥素具有明显的抗肿瘤活性，能够诱导细胞凋亡发生[3]。研究报道显示，去甲斑蝥素治疗后的RA大鼠关节炎评分得到明显改善，去甲斑蝥素具有保护RA的功效[4]。在肿瘤细胞的研究报道显示，去甲斑蝥素作用机制与NF-κB有关，其可以通过下调NF-κB信号的激活水平发挥诱导细胞凋亡的作用[5]。NF-κB激活后可以诱导细胞凋亡和炎症反应，NF-κB信号在RA滑膜成纤维细胞过度激活[6]。目前对于去甲斑蝥素对RA滑膜成纤维细胞凋亡和炎症因子释放的作用还不清楚。本次实验探讨去甲斑蝥素处理对人RA滑膜成纤维细胞凋亡和炎症因子分泌的影响和机制，为RA的治疗提供理论资料。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2018年10月于南通大学附属医院行关节置换术、滑膜切除术RA患者的滑膜组织，患者及其家属知情同意。去甲斑蝥素(纯度≥98%，上海伊奥生物科技有限公司)，RPMI1640溶解，现配现用。NF-κB p65抗体(上海时代生物科技有限公司)；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)测定试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；κB抑制蛋白激酶α(IκB kinaseα,IKK-α)抗体(上海研晶生物技术有限公司)；B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗体(青岛捷世康生物科技有限公司)；Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)；Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗体(上海泽叶生物科技有限公司)；白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)测定试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司)。

1.2 RA滑膜成纤维细胞分离培养和分组 取滑膜组织，放在PBS中反复洗涤3次，小心将滑膜组织中的脂肪、软骨组织、骨片清除干净，用眼科剪将滑膜组织剪碎后放在培养瓶中，添加4 mg/mL Ⅱ型胶原酶，置于37 ℃摇床中孵育振荡反应4 h，100目滤网过滤消化液，离心10 min，置于37 ℃培养箱中培养，观察细胞融合以后用胰蛋白酶消化传代[7]，取第4代细胞用于后续实验。RA滑膜成纤维细胞分为对照组、去甲斑蝥素组，在细胞增殖检测过程中去甲斑蝥素组又分为4个质量浓度，分别为5、10、20、40 μg/mL，其余实验选用20 μg/mL。

1.3 MTT法 将RA滑膜成纤维细胞密度调整到4×105/mL，取100 μL种植到96孔板上，按“1.2”项下方法分离培养和分组，置于37 ℃培养箱中培养24 h，取出培养板，添加MTT溶液10 μL，继续放在37 ℃培养箱中培养4 h，将孔内上清弃掉，添加150 μL DMSO溶液，孵育10 min，酶标仪检测光密度(OD)值。

1.4 流式细胞术 收集已经培养24 h后的对照组、去甲斑蝥素组细胞，胰蛋白酶消化，添加PBS缓冲液至细胞，离心10 min。加入400 μL Binding Buffer充分混合，移液器吸弃5 μL Annexin V-FITC、PI溶液至细胞，用流式细胞仪检测前添加100 μL Binding Buffer混匀。

1.5 Western blot法 收集培养24 h的对照组、去甲斑蝥素组细胞，PBS洗涤2次，添加RIPA蛋白抽提试剂，细胞培养板放在冰上孵育30 min，将细胞裂解液转移到离心管中，在4 ℃下离心10 min，吸取蛋白上清分装至EP管中保存，蛋白样品在上样前与Loading Buffer混合煮沸5 min，SDS-PAGE凝胶电泳每孔蛋白上样量为30 μg，以12%分离胶、5%浓缩胶进行电泳，SDS-PAGE电泳电压设置为恒压100 V，取出分离胶，在90 V、4 ℃下转膜40 min，取出转膜后的NC膜，放在含有封闭液的平皿内，在室温环境中结合反应1 h，然后将NC膜取出，以TBST溶液洗3次，放在含有一抗稀释液的平皿内，在4 ℃环境中结合反应过夜，TBST洗涤，NC膜放在含有二抗稀释液的平皿内，在室温下反应1 h，ECL法显色，内参为β-actin。根据条带的灰度值，分析目的蛋白Bax、Bcl-2、IKK-α、NF-κB p65表达量。

1.6 ELISA法 收集培养24 h的对照组、去甲斑蝥素组细胞培养液上清，ELISA法检测IL-6、IL-8水平，按照相关检测试剂盒说明书进行。

1.7 NF-κB信号激活剂对去甲斑蝥素的影响检测 RA滑膜成纤维细胞接种到6孔细胞培养板中，同时添加含有20 μg/mL去甲斑蝥素、1 μmol/L NF-κB信号激活剂佛波醇脂的细胞培养液培养，作为去甲斑蝥素+佛波醇脂组，以去甲斑蝥素组(按“1.2”项下方法处理)为对照，检测细胞凋亡，Bax、Bcl-2、IKK-α、NF-κB p65蛋白表达及IL-6、IL-8水平。

2 结果

2.1 去甲斑蝥素对RA滑膜成纤维细胞增殖影响 经5、10、20、40 μg/mL去甲斑蝥素处理后，RA滑膜成纤维细胞增殖能力降低(P<0.01)，在20 μg/mL下抑制率接近50%，故后续选用该质量浓度进行实验，见表1。

表1 各组RA滑膜成纤维细胞OD值

2.2 去甲斑蝥素对RA滑膜成纤维细胞凋亡影响 去甲斑蝥素处理后，RA滑膜成纤维细胞凋亡率升高(P<0.01)，细胞Bax蛋白表达增加(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达减少(P<0.01)，见图1、表2。

注：A为细胞凋亡，B为Bcl-2、Bax蛋白表达。

表2 各组RA滑膜成纤维细胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表达

2.3 去甲斑蝥素对RA滑膜成纤维细胞IL-6、IL-8水平的影响 去甲斑蝥素处理后，RA滑膜成纤维细胞IL-6、IL-8水平减少(P<0.01)，见表3。

表3 各组RA滑膜成纤维细胞IL-6、IL-8水平

2.4 去甲斑蝥素对RA滑膜成纤维细胞NF-κB信号通路激活的影响 去甲斑蝥素处理后，RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表达下降(P<0.01)，见图2、表4。

表4 各组RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白

图2 各组RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表达

2.5 NF-κB信号激活剂对去甲斑蝥素影响RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表达的干预作用 与未经NF-κB信号激活剂处理比较，NF-κB信号激活剂与去甲斑蝥素共同处理后RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.01)，见图3、表5。

表5 共同处理后各组RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白

图3 共同处理后各组RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表达

2.6 NF-κB信号激活剂对去甲斑蝥素影响RA滑膜成纤维细胞凋亡及IL-6、IL-8水平的干预作用 与未经NF-κB信号激活剂处理比较，NF-κB信号激活剂与去甲斑蝥素共同处理后RA滑膜成纤维细胞凋亡率降低(P<0.01)，Bax蛋白表达减少(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)，IL-6、IL-8水平增加(P<0.01)，见图4、表6。

注：A为细胞凋亡，B为Bcl-2、Bax蛋白表达。

表6 共同处理后各组RA滑膜成纤维细胞凋亡率，Bcl-2、Bax蛋白及IL-6、IL-8水平

3 讨论

RA是由多种因素诱发而形成的，RA发生时，滑膜组织中巨噬细胞、CD4+T细胞以及B细胞浸润导致滑膜内层增生，而滑膜成纤维细胞是滑膜内层的主要组成部分[8]。RA滑膜成纤维细胞过度增殖、凋亡减少，同时能够分泌大量的炎症因子，促进关节功能丧失和破坏[9]。IL-6、IL-8是常见的RA滑膜成纤维细胞分泌的炎症因子，二者可以诱导组织炎症发生[10]。Bax和Bcl-2分别为促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白，其表达的高低与细胞凋亡密切相关[11]。本实验发现，去甲斑蝥素处理后的RA滑膜成纤维细胞增殖能力下降，细胞凋亡水平增加，细胞分泌的IL-6、IL-8减少，说明去甲斑蝥素具有诱导RA滑膜成纤维细胞凋亡和抑制炎症因子分泌的作用。

去甲斑蝥素是我国研发的抗肿瘤药物，其可以诱导肿瘤细胞凋亡[12]。另外，去甲斑蝥素还具有改善缺血性心脏病、狼疮性肾炎、肾炎等功效[13-15]。研究显示去甲斑蝥素具有保护RA的作用[4]。本实验证实去甲斑蝥素抗RA机制与诱导滑膜成纤维细胞凋亡和抑制炎症因子分泌有关，提示去甲斑蝥素具有明确的抗RA功效。

目前对于去甲斑蝥素在疾病治疗中的作用机制还不明确，已知其可以通过调控下游复杂的信号通路或蛋白表达而发挥作用[16]。去甲斑蝥素通过抑制多发性骨髓瘤、白血病等细胞NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用[17-18]。在超负荷肾病大鼠模型中发现去甲斑蝥素能够抑制NF-κBp65蛋白表达[19]。NF-κB是一个广泛参与细胞正常生理和疾病发生过程的信号转导通路，NF-κB参与人类自身免疫疾病发生，与细胞凋亡、增殖和炎症反应有关[20]。NF-κB在静息状态下以复合物的形式存在，而外界信号刺激后可以诱导IKK激活而促进NF-κB同靶基因的结合，从而促进靶基因的表达[21]。IKK-α是IKK催化亚基，其表达增多是NF-κB信号通路激活的启动步骤[22]。NF-κB p65是NF-κB的亚单位，也是NF-κB发挥生物学作用的必需分子[23]。本实验显示，去甲斑蝥素处理后的RA滑膜成纤维细胞IKK-α、NF-κB p65表达下降，并且NF-κB信号激活剂可以逆转去甲斑蝥素对RA滑膜成纤维细胞凋亡促进和炎症因子分泌的抑制作用，证实去甲斑蝥素作用机制与下调NF-κB信号有关。

去甲斑蝥素具有促进RA滑膜成纤维细胞凋亡和抑制细胞分泌炎症因子的作用，其机制与下调NF-κB信号通路激活水平有关。这为研究去甲斑蝥素在RA中的作用提供了参考。