诃子总黄酮提取工艺的优化及其体外生物活性研究

李国峰， 陈海芳， 郎一帆， 樊慧芳， 陈春兰， 张武岗*， 付 丹

(1.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004；3.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330000)

黄嘌呤氧化酶(XOD)是嘌呤代谢过程中的关键酶，能催化黄嘌呤和次黄嘌呤氧化生成尿酸并产生自由基[1]。当体内尿酸浓度过高时，可导致高尿酸血症并引起痛风发作，同时体内自由基的积累会导致脂质、DNA、蛋白质等生物大分子损伤，从而诱发疾病的发生发展，如糖尿病[2]、慢性肾病[3]、心血管疾病[4]等。因此，从中药中寻找有效调节(抑制)XOD活性的成分是当前研究热点[5]。

诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.、绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实[6]，可用于治疗久泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、咽痛音哑等疾病，被称为“药物之王”，主要含有鞣质类、多酚类、多糖类、挥发油类等[7-9]化合物，其提取物具有保肝[10]、降糖[11]、抗肿瘤[12]、抗炎[13]、解毒[14]等作用，但目前对该药材药理活性的研究仅限于总提物，尚未涉及其总黄酮对XOD的抑制作用和抗氧化活性。因此，本实验采用响应面法优化诃子总黄酮制备工艺后，考察该成分对XOD的抑制作用和自由基的清除能力，以期为今后它在治疗高尿酸血症、痛风中的应用研究提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 诃子购自四川中庸药业有限公司，经江西中医药大学杨世林教授鉴定为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果实。芦丁对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-16031610)；2，2-联苯基-1-苦基肼基(批号C10544590)、维生素C(批号C10250787)、对氨基苯磺酸(批号C10540076)、盐酸萘乙二胺(批号C10636097)、黄嘌呤(批号C10314543)、1,10菲罗啉(批号C10451583)、无水硫酸亚铁(批号C10632300)(上海麦克林生化科技有限公司)；黄嘌呤氧化酶(美国Sigma公司，批号SLCB1290)。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、30%H2O2、无水乙醇等均为分析纯；蒸馏水、超纯水均由江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室提供。

1.2 仪器 GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；JA2003N电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；L-500低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；HH-S恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)；116摇摆式六两装高速中药粉碎机(浙江上虞市道墟宝民仪器设备厂)；酶标仪(美国Thermo公司)；BUCHI Rotavapor R-200旋转蒸发器(厦门精艺兴业科技有限公司)。

2 方法

2.1 线性关系考察 参考文献[15]报道的方法，略有改动。精密称取芦丁对照品25.0 mg，置于50 mL棕色量瓶中，60%乙醇溶解定容，即得500 μg/mL对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL具塞试管中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入4%NaOH溶液5 mL，混匀，60%乙醇定容后静置20 min，于510 nm波长处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=0.008 9X-0.013 9(R2=0.999 0)，在0～60 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取500 μg/mL对照品溶液0.6 mL，按“2.1”项下方法测定吸光度6次，计算得RSD为0.14%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 精密称取脱脂后的干燥药材粉末5.0 g，按“2.2”项下方法提取总黄酮后，于0、1、2、4、8 h按“2.1”项下方法测定吸光度，计算得RSD为1.35%，表明提取液在8 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取脱脂后的干燥药材粉末5.0 g，按“2.2”项下方法平行制备6份提取液，按“2.1”项下方法测定吸光度，计算得RSD为1.78%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 加样回收率试验 精密称取脱脂干燥后的总黄酮含量已知的药材粉末6份，按80%水平加入对照品溶液，按“2.2”项下方法制备6份提取液，按“2.1”项下方法测定吸光度，计算回收率，计算得RSD为1.67%。

2.4 单因素试验 精密称取脱脂后的干燥药材粉末5.0 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，分别考察乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%，液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，提取时间30、60、90、120、150 min，提取温度50、60、70、80、90 ℃对总黄酮提取率的影响。

2.5 响应面法 以总黄酮提取率(Y)为评价指标，乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为影响因素，设计4因素3水平响应面实验，平行3次，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.6 体外生物活性研究

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 乙醇体积分数 如图1所示，总黄酮提取率随着乙醇体积分数增加呈先升后降的趋势，在60%时最高，之后出现明显下降趋势。因此，确定乙醇体积分数为60%。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

3.1.2 液料比 如图2所示，随着液料比增加总黄酮提取率升高，在15∶1时最高，而大于15∶1后趋于平缓。因此，从节约成本方面考虑，确定液料比为15∶1。

图2 液料比对总黄酮提取率的影响

3.1.3 提取温度 如图3所示，随着提取温度增加总黄酮提取率显著升高，在70 ℃时最高，而超过70 ℃后呈现下降趋势，其原因可能为温度过高会使对温度敏感的成分降解为小分子，同时总黄酮结构中的酚羟基会发生氧化反应。因此，从能源、提取率方面考虑，确定提取温度为70 ℃。

图3 提取温度对总黄酮提取率的影响

3.1.4 提取时间 如图4所示，随着提取时间延长总黄酮提取率逐渐升高，在90 min时最高，而超过90 min后趋势不明显，其原因可能为提取时间越长，组织细胞内外浓度差越小，同时部分产物也会发生分解。因此，从能源、效率方面考虑，确定提取时间为90 min。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响

3.2 响应面法 采用Design-Expert 8.0.6软件安排试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

注：左图为三维曲面图，右图为等高线图。

通过Design-Expert 8.0.6软件，得到最优工艺为乙醇体积分数 60.53%，液料比15.53∶1，提取温度69.15 ℃，提取时间98.77 min，总黄酮提取率为5.35%，而在实际操作中将其调整为乙醇体积分数61%，液料比16∶1，提取温度69 ℃，提取时间99 min。再进行3批验证试验，测得总黄酮平均提取率为5.28%，与预测值5.35%接近(相对误差为1.3%)，表明该工艺稳定可靠。

3.3 体外生物活性

3.3.1 抗XOD活性 如图6所示，总黄酮和别嘌醇对XOD均具有抑制作用，并呈显著的剂量依赖关系，IC50为29.22 μg/mL，约为别嘌呤醇的1/22(1.369 μg/mL)。

图6 总黄酮对XOD的抑制率

3.3.2 抗氧化活性

3.3.2.1 清除DPPH自由基 如图7所示，总黄酮具有良好的DPPH自由基清除活性，并呈显著的剂量依赖关系，IC50为0.127 7 mg/mL，接近维生素C(0.101 6 mg/mL)。

图7 总黄酮对DPPH自由基的清除率

3.3.2.2 清除羟自由基 如图8所示，总黄酮具有良好的羟自由基清除活性，并呈显著的剂量依赖关系，IC50为0.518 8 mg/mL，接近维生素C(0.272 8 mg/mL)。

图8 总黄酮对羟自由基的清除率

3.3.2.3 清除亚硝酸根离子 如图9所示，随着总黄酮质量浓度增加，它对亚硝酸根离子的清除率明显升高，在200 μg/mL时最高，并在一定范围内呈量效关系，IC50为42.78 μg/mL，略低于维生素C(11.12 μg/mL)。

图9 总黄酮对亚硝酸根离子的清除率

4 讨论

于姝燕等[20]采用基于正交设计的微波辅助提取技术来优化诃子总黄酮的提取工艺，但由于微波萃取设备存在微波泄露的风险，导致应用受限，而且未对所提取总黄酮的活性进行评价。因此，本实验基于回流提取方式，选择响应面分析法用于优化诃子总黄酮提取工艺参数，该方法在中药有效成分的提取分离领域中已有广泛应用[21-22]，相比于正交试验或均匀试验，它具有试验次数少、周期短、精度好、预测性强、能研究几种因素之间的交互作用、准确度高等优点[23]。

体外活性实验结果表明，在3.75～150 μg/mL质量浓度范围内，诃子总黄酮对XOD的抑制作用呈剂量依赖关系，IC50为 29.22 μg/mL，表明该成分具有体外抗XOD活性，可为寻找相关天然抑制剂提供依据。此外，诃子总黄酮还显示出很强的DPPH自由基清除能力(接近于维生素C)及较好的清除羟自由基、亚硝酸根离子能力，其中亚硝酸根(NO2-)是生成N-二甲基亚硝胺(NDMA)的前体，而NDMA具有较强的致突变和致癌性, 对人体健康会产生潜在的危害。因此，后期可将诃子作为潜在的预防高尿酸血症药物和抗氧化剂进行深入研究。