免疫细胞表面粒细胞集落刺激因子受体的表达调控及其生物学意义①

曹勋红 常英军 黄晓军 赵翔宇 （北京大学人民医院血液研究所，北京100044）

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimu⁃lating factor，G-CSF），又称集落刺激因子3（CSF3）是体内非常重要的细胞生长因子，主要由活化的单核/巨噬细胞、成纤维细胞、骨髓基质细胞等产生，是中性粒细胞产生的关键调节因子［1］。G-CSF 通过与相应细胞表面的特异性受体G-CSFR（即CSF3R）结合，激活一系列的信号转导系统，发挥多种生物学功能，包括调节粒细胞的分化、增殖与存活，动员骨髓造血干细胞入外周血并且诱导移植物中T 细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）免疫耐受等［2-3］。目前已知G-CSF体内应用可通过直接或者间接的方式影响移植物组分中的免疫细胞亚群；然而，目前公认G-CSFR 在髓系来源的细胞表面表达，淋巴细胞表面G-CSFR 的表达调控及其生物学意义研究目前尚不明确。因此综述近年来G-CSF对免疫细胞的功能调控及G-CSFR 在淋巴细胞中表达调控作用的研究。

1 G-CSF 及其受体CSF3R 的分子结构与信号转导

1.1 G-CSF 分子结构及细胞来源 G-CSF 是由CSF3 基因编码而成的由204 个氨基酸构成的相对分子质量为25 kD 的糖蛋白。该蛋白同时包含信号序列和由174 个氨基酸组成的成熟蛋白质；G-CSF包含了4 个圆柱的alpha 螺旋，这些螺旋按不同的方向排列，组成了G-CSF 的蛋白排列形式（如图1）。在生理情况下，人或者小鼠体内几乎检测不到血清G-CSF的水平，然而，一旦发生感染或者损伤等刺激时，G-CSF水平大幅上升，同时肿瘤细胞或组织也会分泌G-CSF 影响肿瘤预后进展［4-5］。有研究认为体内大部分组织均可产生G-CSF，包括成纤维细胞、内皮细胞、间皮细胞等［6-8］；且 G-CSF 的分泌除了受细胞-体液调节外，还和神经调节有关［9］。

图1 G-CSF蛋白的拓扑异构的排列形式Fig.1 Topologically heterogeneous arrangement of G-CSF protein

1.2 G-CSF 受体分子结构及其细胞分布 G-CSFR是造血素受体超家族的成员，该受体没有内在的酪氨酸激酶活性，但当与配体结合后发生构象变化，从而刺激与其细胞质结构域相关的多种酪氨酸激酶的活性，介导不同的信号传导功能。G-CSFR 在细胞中的结构可分为胞膜外段、胞膜段和胞内结构域段。目前认为胞内不同的结构域可结合不同的信号传导分子从而分别影响相应细胞的增殖、分化、存活及负调控通路（如图2）。G-CSFR 在人体内分布广泛，主要可分为造血组织和非造血组织：前者在造血干细胞、粒细胞及其前体细胞上均有分布，发挥促进造血干细胞及中性粒细胞相关前体细胞的增殖、分化和动员［10-11］；在非造血组织中GCSFR 主要分布在内皮细胞、神经系统和胎盘组织等［12］。

图2 G-CSFR受体结构示意图（A）及信号传导通路（B）Fig.2 G-CSFR receptor structure diagram（A）and sig⁃naling pathway（B）

近年来许多研究发现淋系中G-CSFR 也有高表达，并且不同类型淋巴细胞表达各有差异。有文献报道证实T细胞表面G-CSFR主要是诱导性表达，而B细胞表面对G-CSFR的表达是基本存在的［13-14］。

1.3 G-CSF 受体基因多样性与分子结构 与大多数造血系统的受体一样，G-CSFR 包含许多同型异构体。有研究表明，目前有7种不同的G-CSFR同型异构体存在，这些异构体均是由转录本的可变剪接导致（图3）。异构体缺陷导致不可控的信号传递：EHLERS 等［15］在一个“AML-BFM 98”的Ⅲ期临床研究中对除M3的患者使用G-CSF治疗的过程中发现，G-CSFR isoform Ⅳ表达水平低（ISO4＜0.04）的患者经G-CSF治疗后的五年生存率明显低于表达水平高的患者。提示Ⅳ型同形异构体表达缺陷的AML 患者在接受G-CSF 治疗时将不利于患者预后。KATARZYNA 等［16］对 57 例自体移植的患者进行CSF3R（C＞T，rs3917924）的多肽在性分析后发现多发性骨髓瘤患者中CSF3R T等位基因是患者造血干细胞的动员效率低的独立危险因素，并且因此影响中性粒细胞的恢复，进一步影响移植预后。

图3 G-CSFR的同型异构体Fig.3 G-CSFR isoform

1.4 G-CSF 受体连接及其胞内信号传导 当GCSF与其特异性受体G-CSFR结合时，将引起细胞表面G-CSFR 的结构性改变并活化其下游的一系列信号通路如JAK/STAT、PI3K/Akt、p21Ras/Raf/MAPK等［17］。G-CSF 受 体胞内 结构域主 要分为 BOX1，B0X2，B0X3，不同的结构域结合不同的受体酪氨酸家族从而介导不同的功能活性。其中Y704、Y729、Y744、Y764 4 个胞内碳端残基又与G-CSF 信号链的持久性密切相关，ZHUANG等［18］通过酪氨酸-苯丙氨酸替换突变体技术在小鼠32D 和Ba/F3细胞中证实了Y729 是维持Stat5 信号通路的重要位点，且介导了由SOCS1/3 参与的G-CSF 负反馈信号通路的活化。HU 等［19］也通过此技术在 32D 细胞中证实了Y729 是中性粒细胞发育分化的重要靶点，Y729 的突变将导致中性粒细胞向单核细胞分化发育，且在G-CSF 刺激下主要由ERK1/2 信号介导，因此当封闭了ERK1/2 相关信号通路时，中性粒细胞分化发育将逐渐恢复。

阐述G-CSFR 活化后激活的相关下游信号通路（图4）。但是截至目前，G-CSFR 参与的下游信号通路也只局限于简单的直线型的通路阐述，对于这些信号通路间是否存在相互关联及它们是如何在细胞内竞争或者互补目前尚未明确。以上的信号通路的级联反应将影响细胞的存活增殖和分化状态。

图4 G-CSFR经配体活化后介导的信号通路Fig.4 G-CSFR signaling pathway mediated by ligand activation

1.5 G-CSF 受体表达调控 G-CSF 与 G-CSFR 接受引起的级联信号通路介导了多种生物学功能，然而信号的持续活化将不利于机体稳态的维持，因此明晰G-CSFR 如何在细胞中的表达调控过程也尤为重要。TAMILA 等［20］的研究证实了蛋白酶体途径参与了胞内G-CSFR 的降解，从而减弱G-CSF 刺激时GCSFR 的持续激活。除此之外，溶酶体途径也参与了G-CSFR 的蛋白降解调控［21-22］。但是无论是蛋白酶体还是溶酶体途径介导的G-CSFR 调控，都是基于G-CSF配体与之受体结合后会引起的受体内吞再循环。PIPER 等［23］在体外用中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）处理纯化人外周血来源的中性粒细胞通过流式细胞术与Western blot 检测其表面G-CSFR 表达明显下降且会干扰PMN 体外形成集落的能力，进一步完善了G-CSFR 的表达调控机制。然而，目前研究均聚焦于G-CSFR 的降解调控中，对于G-CSFR 在细胞表面诱导表达增多的调节机制目前尚无报道，G-CSFR 转录本的表达增多可以促进G-CSFR 蛋白的翻译增多，同时也应考虑，细胞内部的蛋白转运的改变也可能影响G-CSF在细胞中的分布［24-25］。

2 G-CSF对免疫细胞调控的研究进展

2.1 G-CSF 对中性粒细胞的调控 中性粒细胞是外周血循环中最丰富的白细胞并且在各种炎症条件下起致病作用［26］。G-CSF能促使造血前体细胞分化为完全成熟的中性粒细胞及可促进成熟的中性粒细胞自骨髓释放到组织和外周血中，是中性粒细胞分化发育及功能活化的重要细胞因子［27］。中性粒细胞表面高表达G-CSF 受体，G-CSF 与其高度特异性受体结合发挥重要作用。G-CSF 与G-CSFR 的结合将诱导不同的信号通路调控：Jak-Stat、Ras-MAPK 及 Src 激酶等途径。WARD 等［28］在研究先天性粒细胞减少症的过程中发现活化的STAT5 可以明显增强G-CSFR 介导的增殖反应，小鼠实验也表明当骨髓中缺失STAT5a 及STAT5b 蛋白时，小鼠骨髓无法合成中性粒细胞，提示G-CSFR 在粒细胞增殖及分化过程中发挥重要作用［29］。除此之外，MAPK 也被证实在G-CSF 诱导的中性粒细胞增殖、分化及功能成熟中发挥重要作用［30］。鉴于此，G-CSFG-CSFR 信号轴在中性粒细胞的生物学调控中发挥重要作用。

2.2 G-CSF对T细胞调控 T细胞是介导造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病（acute graft versus disease，aGVHD）的最主要的免疫细胞。G-CSF动员骨髓造血干细胞入外周的同时可增加外周血中10 倍的 T 细胞，尽管如此，移植后 aGVHD 发生率却未显著增加。这与G-CSF能够通过直接和间接的方式诱导T细胞的免疫耐受有关。

2.2.1 G-CSF对T细胞的直接调控 早在2003年，FRANZKE 等［31］就发现体内 G-CSF 应用可诱导 T 细胞表面G-CSFR mRNA 和蛋白的表达，且伴随着供者T 细胞由Th1 型向Th2 型的极化改变。2014 年MACDONALD 等［32］在构建的小鼠动物实验模型中也表明了G-CSF 是直接通过G-CSFR 作用T 细胞从而降低小鼠移植后aGVHD 的发生，虽然AMD3100动员剂（主要是CXCR4轴）也可以动员CD34阳性细胞，但与G-CSF处理的小鼠相比，只有G-CSF动员的小鼠才对GVHD有保护作用，提示T细胞受GCSF调控的作用与CXCR4 轴诱导的动员过程并没有直接影响。体外实验证实G-CSF 不能直接上调T 细胞表面的G-CSFR表达，但是当T细胞经过强刺激预活化后，其表面的CD114表达明显增加，此时G-CSF有协同增强G-CSFR 表达的趋势。该研究结果表明GCSF 体外直接刺激纯化的活化的T 细胞，将降低CD4+效应细胞表面CD25 的表达，且低剂量G-CSF（0.01 ng/ml）即能明显降低T 细胞分泌IFN-γ 能力，高剂量（1~10 ng/ml）G-CSF 刺激增加 IL-4 的分泌且有增强IL-10 分泌的趋势［33］。造血干细胞移植过程中，由于放化疗等影响，机体处于高炎症因子风暴状态，活化型因子及各种抗原的释放是否通过诱导T 细胞表面 G-CSFR 的表达，促使 G-CSF 对 T 细胞的直接调控，进一步影响受者体内T 细胞的表型和功能状态，从而影响预后，需要进一步研究。

2.2.2 G-CSF 对T 细胞的间接调控 尽管G-CSF能够通过直接与T 细胞诱导上调的G-CSFR 结合而发挥免疫调控作用，目前也已有越来越多的证据表明G-CSF 主要通过影响其他细胞从而间接调控T 细胞的功能状态。YANG 等［34］综述了 G-CSF 通过影响Tregs、DCs、单核和MDSCs的功能状态间接诱导T细胞的免疫耐受。见图5。除上所述，G-CSF也能通过调控中性粒细胞诱导T 细胞的免疫耐受。MARINI等［35］首次将G-CSF动员后的外周中性粒细胞根据其表面CD10 分子的表达有无分为成熟的CD10+中性粒细胞亚群和不成熟的CD10−中性粒细胞，进一步分析两亚群的功能后发现，虽然G-CSF 动员并没有增加供者体内上述两亚群细胞的数量，但是G-CSF动员后的供者相比于未被G-CSF动员的供者体内的CD10+LDNs 和CD10+NDNs 细胞比例明显升高，且体外能够抑制活化T 细胞增殖和分泌IFN-γ。这对如何控制T 细胞的活化提供了新的思路。2016 年PEROBELLI 等［36］的小鼠动物实验也证明了 G-CSF体内可以直接诱导能分泌IL-10 的调节性中性粒细胞，且该群细胞在保留GVL 效应的同时能够明显降低移植后aGVHD的发生。

图5 G-CSF通过影响Treg、DCs和MDSC间接改变T细胞的功能状态Fig.5 G-CSF indirectly changes functional status of T cells by affecting Tregs，DCs and MDSC

因此，T 细胞作为诱导GVHD 和发挥抗GVL 效应的核心要素，进一步阐明G-CSF 如何直接或者间接影响T细胞的免疫耐受的分子机制将有利于未来临床药物靶点的研究。

2.3 G-CSF 对DC 细胞的调控 树突状细胞（den⁃dritic cells，DCs）是一群异质性很强的细胞群体，并且根据表面标志物CD11C 和CD123 的分布情况可归类为髓系来源的DCs，CD11C+CD123dim，也即髓样DCs（myeloid dendritic cells，mDCs）和淋系来源的DCs，CD11C−CD123+，也即浆细胞样DC（plasmacytoid dendritic cells，pDC）［37］。G-CSF 动员能够增加健康供者外周血中DCs的绝对数量，并且动员后CD11c−/CD11c+的绝对数比值增加，说明G-CSF 以扩增浆细胞样 DCs 为主［38］。外周血中纯化的 mDC 主要诱导Th1 应答免疫，而 pDC 诱导 Th2 免疫反应［39］。有研究发现G-CSF 动员导致健康供者外周血中DC 细胞表面的CD62L 表达下调，而趋化因子受体CCR7 表达上调，由此推测G-CSF 可能通过改变DCs 表面黏附分子和趋化因子的表达分布实现DCs 的动员［40］。体外实验进一步表明，健康供者应用G-CSF 后血清中显著增加的IL-10 和TNF-α 可以促使单核细胞分化为具有调节功能的DCs，后者与初始T 细胞共培养时，可诱导分泌TGF-β和IL-10的Tregs产生，从而抑制同种异体反应性T 细胞的活化［41］。尽管G-CSF对DCs 的调控目前已经得到广泛的研究，然而以往文献都是基于体内G-CSF 应用过程中进一步研究DCs生物学功能的变化，相关的基础研究甚是缺乏。BHARADWAJ 等［42］体外 G-CSF（20 ng/ml）刺激人单核细胞来源的DCs后Western blot检测发现pstat3明显升高，提示G-CSF 可能通过JAK/STAT 信号通路介导DCs的分化发育。JAK/STAT是G-CSF/G-CSFR介导的直接下游通路，因此提示G-CSF 可能通过直接信号通路参与了DCs生物学功能的改变。与此同时，MORRIS 等［43］2008 年首次阐述了全身放射治疗（total body irritation，TBI）后的小鼠体内的抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC）将高表达 GCSFR，而同时使用G-CSF 合并治疗时，将诱发炎症APCs的反应，从而诱导急慢性GVHD 的发生。提示DC 细胞上G-CSFR 表达可能参与促炎作用。在SIVAKUMAR 等［44］构建的小鼠 cGVHD 模型中得以进一步证实，即B6.Sle2c2小鼠由于其DCs细胞低的表达G-CSFR，促进了调节性CD8a+DCs 的存留并进一步促使T 细胞向具有Foxp3 的调节性T 细胞的分化发育，诱导免疫耐受。以上均说明G-CSF 可能通过G-CSFR 直接参与了DCs 功能的调节，但是具体的调节机制仍需要更多的研究。

2.4 G-CSF 对单核细胞的调控 G-CSF 动员能够显著增加健康供者外周血移植物组分中的CD14+的单核细胞的数量，且该类细胞以分泌IL-10 这类调节性细胞因子为主，与此同时，G-CSF动员能够显著抑制单核细胞分泌 IL-12、TNF-α、IFN-γ 等炎症细胞因子［45-47］。最近，MAVD 等［48］发现人和小鼠接受 GCSF 后，其外周造血干细胞中的CD14+单核细胞不仅能够以剂量依赖性的方式抑制T 细胞的增殖，还可在活化T 细胞分泌的IFN-γ 的刺激下，产生NO，从而诱导同种异体T 细胞凋亡，凋亡的T 细胞被巨噬细胞吞噬后释放的TGF-β 能够促进Treg 细胞扩增，进一步诱导T 细胞免疫耐受。单核细胞上有GCSFR表达，但G-CSF是直接还是间接作用于单核细胞功能的调节，目前尚缺乏研究。

2.5 G-CSF对NK细胞的调控

2.5.1 G-CSF与NK细胞增殖分化的关系 MILLER等［49］体 外 实 验 表 明 G-CSF 可 抑 制 外 周 CD34+Lin−DR−前体细胞分化为 NK 细胞，而外源性 G-CSF对成熟NK 细胞增殖并无影响性，也不排除NK 细胞在体内经G-CSF处理之后细胞毒性及增殖能力下降是与G-CSF 对NK 细胞的间接作用有关，但是具体调控机制仍需要不断研究。本课题组应用CFSE 体外标记G-CSF 体内运用前后的骨髓NK 细胞，比较NK 细胞体外7 d 增殖的差异，发现NK 细胞的增殖并无明显差别，但并没有探讨G-CSF 体内应用前后NK 细胞前体细胞向NK 细胞分化发育能力是否不同［50］。

2.5.2 G-CSF 对NK 细胞杀伤活性的影响 SCH⁃LAHSA 等［51］研究发现 G-CSF 能下调包括 NKp44、NKp46、NKG2D在内的表面活化型受体和减少IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-6、IL-8 细胞因子分泌，从而影响NK 细胞表型变化并降低其细胞毒性。但是我中心临床研究显示G-CSF 体外并未降低健康供者骨髓NK 细胞的细胞毒性，然而却能降低分泌IFN-γ 的NK 细胞亚群（NK1），与此同时增加分泌IL-13 的NK细胞（NK2），分泌 TGF-β 的 NK 细胞（NK3）和分泌IL-10 的 NK 细胞（NKr）的比例［50］。从理论上来讲，这可能会降低移植物的抗白血病效应（Graft versus leukemia，GVL 效应）。然而有研究发现G-CSF 虽然削弱了NK 细胞毒性，但NK1 亚群的减少及NK2、NK3、NKr 亚群比例增多可能对预防早期aGVHD 发病率有效；且当G-CSF 逐渐代谢消耗后，NK 细胞的GVL 效应抑制也被解除［52］。基于此，如何发挥移植物中NK 细胞的最大GVL 作用仍然有赖于研究者们对G-CSF在NK细胞免疫调控上的深入研究。

尽管G-CSF 对NK 细胞生物学功能的研究已有不少研究报道，但缺乏对于G-CSF 对NK 细胞免疫调控的生物学机制研究。2011 年 LAURA 等［51］在监测体内NK 细胞动员前后的G-CSFR 表达情况后发现NK 细胞表面高表达G-CSF 受体，且体外细胞因子IL-2和IL-15联合刺激纯化的NK细胞后，G-CSFR可被诱导性的表达，但是对于G-CSFR 在NK 细胞表达所代表的生物学意义尚不清楚，猜想G-CSF 可能通过其高度特异性受体G-CSFR 参与了NK 细胞的生物学功能调控，对此还要更多的研究来进一步证实该假设。

综上可知，G-CSF 可以通过直接或间接的方式调控多种免疫细胞，主要诱导免疫耐受从而降低移植后aGVHD 的发生；另一方面，可通过多种机制保留移植物中的免疫细胞的GVL 效应。从而实现移植后GVHD 和GVL 的分离，是目前临床上广泛应用的细胞因子。

3 G-CSFR表达的病理生理意义

3.1 G-CSF 表达与炎症 G-CSF 可以通过诱导多种免疫细胞耐受从而达到炎症调节的作用［53］。然而G-CSFR，作为G-CSF的高度特异性受体在其中发挥怎样的作用呢？有研究表明G-CSF 受体阻断后，将改善甲基化牛血清白蛋白（methylated BSA，mBSA）导致的小鼠关节痛和炎症。中性粒细胞是炎症发生的主要调控亚群，但是在该模型中，小鼠中性粒细胞亚群（CD11b+Ly6G+F4/80−）的CS3FR 表达并无改变，因此猜测抗G-CSF 受体降低炎症反应可能是不依靠中性粒细胞途径参与的［54］。有研究显示DCs 细胞表面G-CSFR 的表达也会影响到炎症进展，慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus dis⁃ease，cGVHD）致病等，可能与免疫反应的过度活化有关。

3.2 G-CSFR 表达与肿瘤 有研究表明，人体内高G-CSF 水平及G-CSFR 水平是胃癌预后不良的危险因素：一方面是由于G-CSF 可以通过直接作用刺激胃癌细胞的增殖和迁移，另一方面G-CSF 能够促血管生成［55-56］。由于G-CSF 在机体炎症背景下发挥诱导免疫耐受及可促血管生成的作用，抗G-CSF 的因子刺激可能对肿瘤生长有抑制作用［57-58］。MORRIS等［59］研究小鼠结直肠癌的模型表明体内拮抗G-CSF因子治疗确实能通过增加具有免疫效应能力的NK细胞和T细胞，并且降低肿瘤内分泌IL-10负性调节因子的巨噬细胞的数量，从而达到抗肿瘤的作用。同时，这一模型也进一步证明无论是人还是小鼠结直肠癌，均伴随着G-CSFR 和G-CSF 水平的升高，也进一步促进了G-CSF通过G-CSF受体在肿瘤背景中传递的促癌效应。TAKESHIMA 等［60］在 C57BL/6 背景小鼠体内构建的前列腺肿瘤的模型表明，放疗之后能促进一群CD11b+Gr−1high+的中性粒细胞入肿瘤并通过ROS 毒性杀伤肿瘤细胞，有趣的是G-CSF的合并使用有利于体内清除肿瘤的速度，这间接说明G-CSF/G-CSFR 信号参与了抗肿瘤效应。综上所述，对于G-CSF 及其下游的G-CSFR 通路在肿瘤背景下是发挥保护作用还是促进作用目前尚无定论，我们猜测，G-CSFR 介导的肿瘤效应可能与其活化的细胞群体有关，从而介导相关的信号调控。

4 结语

G-CSFR 在人体组织的分布广泛，G-CSF 在与其高度特异性受体G-CSFR 结合后发挥多种生物学功能。然而目前其受体多样性及组织细胞功能差异性仍缺乏相应的文献报道支持，特别是在淋巴免疫细胞上的可诱导调控及其介导的相关生物学功能仍不清楚。因此明确G-CSFR 的表达调控是未来研究的重点；且G-CSF的生物作用性广泛，无论是生理或是病理情况下均发生重要的调节作用，明确GCSF及受体的生物学调节机制显得极为重要。