体检人群载脂蛋白E基因型与血清小而密低密度脂蛋白胆固醇的关系*

李秀锋,高 征,刘艳慧,徐 旭,梁国威

航天中心医院检验科，北京 100049

载脂蛋白E(ApoE)是主要的胆固醇载体，作为低密度脂蛋白(LDL)受体的配体，参与脂质代谢中受体介导的乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)残粒的清除和胆固醇的逆向转运，在维持外周组织和大脑的脂质稳态方面起重要作用[1-2]。ApoE基因常见的2个单核苷酸多态性(rs429358和rs7412)产生3个不同的等位基因(ε2、ε3和ε4)和6个ApoE基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4 和ε4/ε4)[3]。有研究显示，ε2纯合子与Ⅲ型高脂蛋白血症相关[4]，而ε4等位基因则与高胆固醇血症、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病发病风险增加有关[5-6]。血清小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)已成为动脉粥样硬化新的独立危险因素[7-8]。但影响sdLDL-C生成的确切机制目前并不完全清楚。由于LDL是由VLDL转化而来，而ApoE在VLDL清除方面起重要作用，ApoE基因变异是否与血清sdLDL-C水平变化具有显著相关性，目前相关文献鲜见报道。本研究在大样本体检人群中探讨了ApoE基因型与血清sdLDL-C的相关性，以期明确ApoE基因是否是血清sdLDL-C水平变化的遗传影响因素。

1 资料与方法

1.1一般资料 研究对象为2018年12月至2019年12月于航天中心医院行体检的人群1 446例，平均年龄(47±11)岁，男830例，女616例。根据调查问卷和实验室检测指标，排除妊娠和伴有急、慢性感染性疾病、血液系统及恶性肿瘤等疾病的患者。本研究通过航天中心医院医学伦理委员会审查(项目批号：201900301-YN-14)，研究对象均签署知情同意书。收集研究对象年龄、性别、身高、体质量等基础资料，计算体质量指数(BMI)。

1.2方法 抽取研究对象清晨空腹静脉血，以3 000 r/min离心5 min后取血清2 mL，使用日本奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪及配套试剂，用于肝功能[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)]、肾功能[尿素(UREA)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)]、血脂四项[三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]、sdLDL-C及空腹血糖的检测，4 h内检测完毕。EDTA抗凝外周全血2 mL用于基因组DNA提取，提取后的基因组DNA-80 ℃冻存备用。

1.2.1ApoE基因型检测 使用天根生化科技(北京)有限公司的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒进行全血DNA提取。所提取的DNA用紫外分光光度计测定水平及纯度，要求DNA的吸光度(A)260/A280在1.8～2.0 nm。使用武汉友芝友医疗科技股份有限公司的人类ApoE基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，在美国ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行检测。该试剂盒检测ApoE2 526C>T、ApoE4 388T>C两个位点的多态性。试剂盒最低检出限可达到1 ng标本中能准确检测出对应基因型。重复检测对应基因型10次，应检出对应基因型，且检测结果Ct值变异系数(CV)≤5%。实验结果由2名工作人员核对判读，若2名工作人员对某标本判读结果不一致，则复查该标本。

1.2.2血清sdLDL-C水平检测 采用过氧化物酶法，在日本奥林巴斯AU 2700全自动生化分析仪上进行定量检测。配套试剂及校准品由北京九强生物技术有限公司提供。分析灵敏度：标本水平为2.59 mmol/L(100.0 mg/dL)时，其A值变化在0.0 500～0.2 500。对高、低不同水平血清标本重复测定标本10次，CV≤10%。仪器定期校准，质控测定值在标示值范围内。

2 结 果

2.1ApoE基因型和等位基因分布频率 1 446例研究对象中共检出6种ApoE等位基因型，ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4、ε4/ε4基因型所占比例分别为1.11%(16/1 446)、13.07%(189/1 446)、68.26%(987/1 446)、1.87%(27/1 446)、14.45%(209/1 446)、1.24%(18/1 446)。其中ε3等位基因占比最大，占82.02%(2 372/2 892)，ε2等位基因、ε4等位基因占比分别为8.58%(248/2 892)、9.41%(272/2 892)。ε2位点和ε4位点等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.584，P=0.108和χ2=3.240，P=0.072)，显示标本来自一个稳定的群体，具有群体代表性。

2.2ApoE基因型间血清sdLDL-C水平及临床指标比较 从ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4至ε4/ε4，各基因型之间的血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平比较，差异均有统计学意义，且呈升高趋势(P<0.001)，其余各项指标的差异均无统计学意义(P>0.05)；单纯ε2位点突变与ε3/ε3基因型比较，ε2/ε2型和ε2/ε3型的血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平降低(P<0.001)；单纯ε4位点突变与ε3/ε3基因型比较，ε4/ε4型与ε3/ε4型的血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平升高(P<0.05)，ε3/ε4型的血清TC和LDL-C水平与ε3/ε3型比较，差异无统计学意义(P>0.05)；对于ε2位点和ε4位点共同杂合变异型ε2/ε4型，其血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平低于ε3/ε3型(P<0.05)，见表1。

表1 血清sdLDL-C水平及临床指标在不同ApoE基因型间的比较

2.3ApoE基因型对血清sdLDL-C水平的影响 根据ApoE基因型与血清sdLDL-C水平的对应关系，将ApoE基因ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4型依次赋值1、2、3、4、5、6的梯度性增加作为自变量，采用多元线性回归分析，模型1、模型2、模型3、模型4和模型5依次分别为无任何变量控制；控制年龄和性别；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、UREA、UA、CREA、ALT、AST、GGT、ALP。分析显示ApoE基因型对血清sdLDL-C水平的影响均有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 ApoE基因型对血清sdLDL-C水平的影响

进一步针对ε2位点，将ε3/ε3、ε2/ε3、ε2/ε2型依次赋值1、2、3，进行多元线性回归分析，模型1、模型2、模型3、模型4和模型5依次分别为无任何变量控制；控制年龄和性别；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、UREA、UA、CREA、ALT、AST、GGT、ALP。结果显示，ApoE的ε2位点对血清sdLDL-C水平的影响有统计学意义(P<0.001)，单纯ε2位点(ε2/ε2和ε2/ε3)突变的人群血清sdLDL-C水平降低，见表3。

表3 ApoE的ε2位点对血清sdLDL-C水平的影响

进一步针对ε4位点，将ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4型依次赋值1、2、3，进行多元线性回归分析，模型1、模型2、模型3、模型4和模型5依次分别为无任何变量控制；控制年龄和性别；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C；控制年龄、性别、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、UREA、UA、CREA、ALT、AST、GGT、ALP。结果显示，ApoE的ε4位点对血清sdLDL-C水平的影响有统计学意义(P<0.05)，单纯ε4位点(ε4/ε4与ε3/ε4)突变的人群血清sdLDL-C水平升高，见表4。

表4 ApoE的ε4位点对血清sdLDL-C水平的影响

3 讨 论

本研究结果显示，在体检人群ApoE的6种基因型中，与ε3/ε3型比较，ε2/ε2型和ε2/ε3型的sdLDL-C水平降低，ε4/ε4型和ε3/ε4型的sdLDL-C水平升高，ε2与ε4共同杂合变异型ε2/ε4型的sdLDL-C水平低于ε3/ε3型。多元线性回归分析显示，控制各种与血清sdLDL-C水平相关的指标后，ApoE的ε2、ε4位点对血清sdLDL-C水平的影响有统计学意义(P<0.05)，ε2/ε2、ε2/ε3型血清sdLDL-C水平降低，ε4/ε4、ε3/ε4型血清sdLDL-C水平升高。

ApoE是人体血液中最主要的载脂蛋白成分之一,存在于CM、VLDL、中间密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)中[9-10]。受体代谢途径是脂蛋白代谢最主要的途径,由ε2、ε3和ε4编码的3种ApoE异构体具有不同的受体结合活性,必然影响血脂代谢速度,导致机体血脂水平的差异[10-11]。王克勤[12]研究认为，ApoE2与LDL受体的结合活性只有ApoE3的1%～2%,使CM和VLDL及其残粒不能被肝脏摄取,血浆VLDL水平上升；同时由于VLDL转变为LDL减少,导致肝细胞LDL受体表达上调,细胞摄取LDL增加,使血浆中LDL-C水平进一步降低。相反地,ApoE4与LDL受体亲和力高,使CM和VLDL残粒代谢加速,肝细胞内游离胆固醇增加,肝细胞表面LDL受体下调,体内LDL分解代谢减少,最终使LDL-C水平升高。本研究结果显示，单纯ε2位点(ε2/ε2和ε2/ε3)突变的人群血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平均降低；单纯ε4位点(ε4/ε4与ε3/ε4)突变的人群血清sdLDL-C水平升高，ε4/ε4型血清TC和LDL-C水平也升高；ε2位点和ε4位点共同杂合变异型ε2/ε4型血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平低于ε3/ε3型，与上述研究的生理生化过程一致，并且ε2与LDL受体结合活性降低的作用大于ε4与LDL受体结合活性升高的作用，从而引起ε2/ε4型血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平的降低。

血清sdLDL-C是LDL-C的亚型之一，影响sdLDL-C生成的确切机制目前并不完全清楚。LDL-C颗粒的形成涉及VLDL生成、VLDL-IDL-LDL级联中的脂肪分解、各种脂蛋白(CM、VLDL、LDL和HDL)间的脂质交换和载脂蛋白交换，以及脂代谢相关酶等多个环节[13]。而ApoE在VLDL清除方面起重要作用，但ApoE基因变异是否与血清sdLDL-C水平变化具有显著相关性，目前相关文献鲜见报道。NIU等[14]研究发现，ApoE2人群血清sdLDL-C水平降低，与本研究结果一致，但未进行ApoE基因型与血清sdLDL-C水平的独立相关性分析。SING等[15]研究认为，多达16%的LDL-C遗传变异可能与ApoE基因位点的等位基因差异有关。本研究经过多元线性回归分析发现，控制各种与血清sdLDL-C水平相关的指标后，ApoE的ε2、ε4位点对血清sdLDL-C水平的影响有统计学意义(P<0.05)，ε2/ε2、ε2/ε3型血清sdLDL-C水平降低，ε4/ε4、ε3/ε4型血清sdLDL-C水平升高，说明ApoE基因是血清sdLDL-C水平变化的遗传影响因素之一。

综上所述，ApoE基因多态性与血脂代谢密切相关，是血清sdLDL-C水平变化的独立遗传影响因素。ε2等位基因可降低血清sdLDL-C水平，而ε4等位基因则可升高血清sdLDL-C水平。本研究的局限性是研究对象属于自然人群，后续会进一步研究疾病人群中ApoE基因型分布特征及其与血清sdLDL-C的相关性。