无创产前筛查非整倍体及额外检测信息在产前诊断中的应用

黄丽婵，陈亚军，雷庆华

广东省韶关市妇幼保健院遗传与产前诊断中心，广东韶关 512026

无创产前筛查(NIPT)是指通过高通量测序技术(HTS)检测母体外周血中胎儿游离DNA(cff-DNA)并进行生物信息学分析，计算出胎儿罹患21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征等染色体疾病的风险。1997年，LO等[1]发现了母体外周血循环体系中存在cff-DNA小片段，此后大量学者研究证实了母体中cff-DNA的存在。随着HTS的灵敏度升高及其在临床的广泛应用，基于母体外周血检测胎儿染色体疾病的NIPT成为可能。

近十年来，NIPT由于无创性、高准确性和高灵敏性，得到广大临床医生和孕妇的认可，被广泛应用于产前筛查，积累了大量的临床数据。NIPT高风险的孕妇需要进行介入性产前诊断、染色体核型G显带分析或者同时进行染色体微阵列分析(CMA)。本文回顾性分析2015年1月至2020年12月于本院产前诊断专科门诊就诊的因NIPT提示高风险而接受介入性产前诊断的孕妇，统计、分析NIPT提示非整倍体数目异常和其他额外检测信息异常的检出情况，通过染色体核型G显带分析结果和CMA结果验证，探讨该技术在产前诊断中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2020年12月因NIPT高风险接受介入性羊水穿刺产前诊断的孕妇(本院及外院转诊)共126例作为研究对象，年龄21～45岁，孕周16～27周。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象及家属均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂

1.2.1NIPT DA8600高通量测序仪(中山大学达安基因股份有限公司)、ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司) 、JW-1042R低速冷冻离心机及JW-2017HR高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器有限公司)、DNA提取试剂盒(磁珠法，中山大学达安基因股份有限公司)。

1.2.2染色体核型G显带分析 Axio imager Z2染色体全自动扫描仪(德国Zeiss公司)、Ikaros核型分析软件(德国Metasystems公司)、Class100型CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo fisher scientific公司)、羊水培养基(广州和能生物有限公司和以色列Biological Industries公司)。

1.2.3CMA CytoScan®750K芯片、GeneChip®洗涤工作站450Dx v.2、GeneChip®杂交炉645、GeneChip®3000 7G 高分辨率扫描仪及自动装片机(美国Affymetrix公司)、DNA试剂提取盒(德国QIAGEN公司)。

1.3方法

1.3.1NIPT 抽取孕妇外周血10 mL，预冷低速离心机4 ℃、1 600×g离心10 min，吸取上清血浆，转移至2.0 mL EP管中。预冷高速离心机，4 ℃，放入上步所得2.0 mL EP管，16 000×g离心10 min，吸取上清血浆，转移至置于2.0 mL EP管中，每管转入750 μL两次离心后分离血浆，并置于-80 ℃低温保存。通过血浆分离、cff-DNA提取、DNA测序文库构建、高通量测序模板制备、高通量测序上机测序、生物信息数据分析，计算胎儿患21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、性染色体数目异常等染色体非整倍体疾病的风险概率。结果判读：chr21的Z值≥3.000提示胎儿为21-三体综合征高风险；chr18的Z值≥3.000提示胎儿为18-三体综合征高风险；chr13的Z值≥3.000提示胎儿为13-三体综合征高风险；若高通量检测发现其他染色体可能存在异常时，其报告形式为附加检测结果。

1.3.2染色体核型G显带分析 彩超可视下抽取羊水20 mL，分别注入2支无菌管，每管10 mL，均在细胞培养后进行染色体核型G显带分析。经过细胞培养、换液、传代、收获、滴片、染片、Axio imager Z2染色体全自动扫描仪分析，染色体核型诊断参照人类细胞遗传学国际命名标准(ISCN2016)[2]。

1.3.3CMA 彩超可视下抽取羊水10 mL注入1支无菌管，直接进行CMA，包括样本DNA制备、芯片杂交、芯片洗脱和染色、扫描、生物信息数据分析。样本基因组DNA数据分析参照OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等数据库资料。基因组DNA拷贝数变异(CNVs)的分类参照美国医学遗传学与基因组学学会颁布的应用指南(2011年)[3]，分为4类：(1)临床致病性CNVs；(2)可能临床致病性CNVs；(3)临床意义不明CNVs；(4)良性CNVs。

1.4判断方法 确诊非整倍体胎儿穿刺数=当年羊水穿刺总例数/染色体核型G显带分析确诊的非整倍体胎儿例数，数值越高说明进行了不必要介入性羊水穿刺的胎儿例数越多。嵌合体是指一个生物个体中存在来源于同一合子产生的两个或多个细胞系现象。嵌合现象可以发生在常染色体、性染色体上。本文的嵌合体类型主要是数目异常之间的嵌合。

1.5随访 因NIPT高风险进行介入性羊水穿刺产前诊断的孕妇均由本中心产前诊断专业人员进行电话随访，了解新生儿生长发育情况及健康状况，并形成记录。

1.6统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1NIPT提示高风险总体情况 本研究共收集126例因NIPT高风险接受介入性羊水穿刺产前诊断的孕妇(本院及外院转诊)。NIPT结果报告范围为常见的21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征和性染色体非整倍体数目异常。其中，NIPT非整倍体高风险108例包括21-三体综合征高风险62例，18-三体综合征高风险19例，13-三体综合征高风险16例，性染色体数目异常者11例。额外检测信息提示其他染色体异常18例，其中染色体缺失8例，染色体重复10例。

2.2NIPT提示非整倍体高风险染色体核型G显带分析结果 NIPT提示非整倍体高风险的108例孕妇均进行介入性羊水穿刺产前诊断。羊水细胞染色体核型G显带分析培养成功率为100.00%。其中，21-三体综合征确诊53例，阳性符合率为85.48%(53/62)；18-三体综合征确诊13例，阳性符合率为68.42%(13/19)；13-三体综合征确诊5例，阳性符合率为31.25%(5/16)；性染色体数目异常确诊7例，阳性符合率为63.64%(7/11)。各类型阳性符合率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3NIPT提示非整倍体高风险例数增加对确诊非整倍体胎儿穿刺数的影响 因NIPT提示非整倍体高风险进行介入性羊水穿刺产前诊断的例数从2015年的3例增加到2020年的27例，相反，确诊非整倍体胎儿穿刺数在下降，从2015年的42下降到2020年的20，减少约50%胎儿不必要进行介入性产前诊断。2015-2020年各年间确诊非整倍体胎儿穿刺数比较，差异有统计学意义(χ2=12.534,P<0.05)，见表1。

表1 NIPT高风险例数增加对产前诊断非整倍体胎儿穿刺数的影响

2.4NIPT提示非整倍体高风险染色体核型分析的嵌合体情况 2015—2020年NIPT高风险孕妇126例，均进行染色体核型G显带分析，其中8例确诊为嵌合体核型：21-三体综合征有6例，18-三体综合征有1例，性染色体非整倍体异常1例，嵌合比例为5.00%～74.65%，见表2。

表2 NIPT高风险染色体核型分析的嵌合体情况

2.5NIPT额外检测信息提示其他染色体异常的产前诊断结果 NIPT高风险孕妇126例，其中18例NIPT额外检测信息提示其他染色体异常，18例孕妇接受介入性穿刺抽取羊水同时进行染色体核型G显带分析和CMA。检测结果见表3。

2.6电话随访结果 NIPT结果提示非整倍体高风险孕妇108例，经羊水细胞染色体核型G显带分析确诊78例，全部终止妊娠，30例假阳性胎儿足月分娩，新生儿未见明显异常。NIPT额外信息提示其他染色体异常18例，经CMA检测验证，检测结果较一致的有5例，阳性符合率为27.78%(5/18)，具体结果如下：通过羊水细胞染色体G显带核型分析和CMA检测，其中11例胎儿检测结果未见明显异常(不包括编号4胎儿)，11例足月分娩，新生儿未见明显异常；2例染色体G显带核型分析未见异常，CMA检测出临床意义不明CNVs，胎儿足月分娩，新生儿未见明显异常；1例因孕后期发现彩超异常，明确胎儿预后不良，终止妊娠；2例检出致病性CNVs和2例检出单亲二倍体(UPD)，终止妊娠。见表3。

表3 NIPT提示额外检测信息异常的产前诊断结果

3 讨 论

一直以来，唐氏筛查(孕早期、孕中期)高风险孕妇需要进行介入性产前诊断，抽取胎儿(绒毛、羊水、脐血)细胞进行体外培养，并采用细胞遗传染色体核型G显带分析进行诊断。由于唐氏筛查高风险假阳性率高，约95%孕妇进行了不必要的穿刺，染色体病发生率仅为2.14%[4]，一部分健康胎儿因唐氏筛查而丢失，增加了孕妇心理负担。NIPT具有无创性、高通量、高准确性和高灵敏性，对唐氏综合征检出准确性高达99%[5]，孕妇接受度高。

3.1NIPT对非整倍体染色体疾病的检测效能 本研究共收集NIPT高风险孕妇126例，其中有108例提示21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征和性染色体数目异常，全部进行了介入性羊水穿刺产前诊断。羊水细胞染色体核型G显带分析提示：21-三体综合征阳性符合率为85.48%；18-三体综合征阳性符合率为68.42%；13-三体综合征阳性符合率为31.25%；性染色体数目异常阳性符合率为63.64%。各类型的阳性符合率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。NIPT出现假阳性的原因可能为双胎之一死亡、母亲染色体异常、限制性胎盘嵌合、胎儿DNA拷贝数异常、母体血中cff-DNA水平过低、母亲罹患肿瘤等[6-8]。

3.2NIPT高风险例数增加与确诊非整倍体胎儿穿刺数的关系 本中心李锦昌等[9]报道了NIPT高风险孕妇进行介入性产前诊断的数量增加与确诊非整倍体胎儿穿刺数间的关系。经过本中心近几年的数据分析，提示NIPT高风险例数增加与确诊非整倍体胎儿穿刺数关系密切。由于唐氏筛查假阳性率高，在2015年确诊非整倍体胎儿穿刺数为42才能诊断出1例非整倍体胎儿，NIPT具有高灵敏度和高准确性，随着NIPT高风险孕妇进入介入性产前诊断的数量增加，到2020年确诊非整倍体胎儿穿刺数下降到20就能诊断出1例非整倍体胎儿，避免了近50%胎儿进行介入性产前诊断，降低了胎儿流产风险，减轻了孕妇的心理负担，有效地节约了医疗卫生资源。

3.3NIPT嵌合体染色体非整倍体疾病的检测效能 从表2可见，NIPT不仅可以筛查出纯合的非整倍体染色体疾病，还可以筛查出不同嵌合比例的非整倍体染色体疾病。嵌合体是在受精卵形成后的胚胎发育过程有丝分裂中形成的。在个体胚胎发育过程中，嵌合体形成的时间(早或晚)及部位(分化的器官)不同，嵌合体个体临床表现差异很大。在126例NIPT高风险孕妇中，有8例经染色体核型G显带分析诊断为嵌合体核型，嵌合比例为5.00%～74.65%，其中21-三体综合征有6例，18-三体综合征有1例，性染色体非整倍体异常1例，说明NIPT具有高准确性和高灵敏性，对于不同嵌合比例的嵌合体染色体非整倍体异常具有一定的检测效能。

3.4NIPT提示额外检测信息异常的检测效能 染色体微缺失/微重复综合征是由于染色体拷贝数变异引起的，能引起一系列临床症状的染色体疾病，可以为新发，也可以从无症状或轻中度症状父母遗传而得。有学者研究报道，染色体微缺失/微重复在健康人群中的发生率为0.1%～0.3%[10]。本研究中,NIPT提示额外检测信息异常与CMA结果较一致的有5例(表3中胎儿编号5、6、13、14、16)。其阳性符合率为27.78%(5/18)，略低于姜楠等[11]报道的检测结果，这可能与本研究NIPT高风险孕妇来自不同的实验室有关，因不同实验室NIPT检测平台不同，高通量测序深度不一致或生物信息数据分析程度不同。

NIPT不仅可以检测常见非整倍体染色体疾病，还可以检测出其他染色体异常，包括胎儿CNVs等。但是，不同染色体的阳性符合率不一样，染色体含有较少基因组信息的阳性符合率较高，本研究中21-三体综合征阳性符合率达85.48%，13-三体综合征阳性符合率较低，为31.25%，而胎儿CNVs的阳性符合率为27.78%，与既往研究报道中NIPT胎儿非整倍体阳性符合率和胎儿CNVs阳性符合率基本一致[12-14]。在临床工作中选择合适的测序深度，降低NIPT的假阳性率，满足临床的需求，还需要进一步探讨。

作为无创性筛查技术，NIPT可以大规模并行检测，且检测时间范围广(孕周12～22+6周)，若检测结果提示非整倍体高风险或额外检测信息异常时，必须进行介入性羊水穿刺产前诊断。值得注意的是，本研究发现，在产前筛查引入NIPT，能有效降低确诊非整倍体胎儿穿刺数，提高非整倍体胎儿确诊效能。NIPT提示额外检测信息异常，包括胎儿CNVs，往往会使胎儿发育出现结构异常，通常这些胎儿的结构畸形是在孕中后期三级彩超被发现。NIPT因其高通量测序，仅需要通过无创性方法抽取母体外周血进行胎儿cff-DNA检测，若胎儿DNA携带有染色体异常，可提前在孕中期发现，从而进入产前诊断，减少胎儿流产风险，减轻孕妇的身体伤害和心理负担。NIPT非整倍体检测结果及额外检测信息在产前诊断中具备一定的临床应用价值，但筛查结果提示阳性者必须进行介入性产前诊断，并结合产前诊断结果、超声检查、电话随访等进行全面的遗传咨询和风险评估。