淋病奈瑟菌对阿奇霉素的敏感性及mtrR基因突变分析*

廖 娟，林 滢，方 凤，詹文芳，刘继来

福建中医药大学附属人民医院检验科，福建福州 350004

淋病奈瑟菌是性传播疾病淋病的致病菌，其显著特点是能迅速累积不同的突变，从而获得对抗菌药物的耐药性[1]。自20世纪30年代中期开始使用磺胺类药物以来，淋病奈瑟菌对用于治疗淋病的大部分抗菌药物都产生了耐药性[2]。世界卫生组织(WHO)推荐将头孢菌素联合阿奇霉素作为无并发症淋病的一线药物[3]，但不断增加的耐药性给淋病的治疗带来了巨大的挑战，已经出现淋病奈瑟菌对阿奇霉素耐药的相关报道[4-5]。本文通过检测淋病奈瑟菌对阿奇霉素的耐药性并对其相关耐药基因mtrR进行测序分析，以了解该菌的耐药特征及耐药机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院2018—2020年临床分离的43株淋病奈瑟菌菌株，质控菌株为ATCC49226。

1.2方法

1.2.1药敏试验 采用琼脂稀释法检测淋病奈瑟菌对阿奇霉素的最小抑菌浓度(MIC)，阿奇霉素购于上海陶素生化科技有限公司，GC琼脂粉购于上海艾礼生物科技有限公司，无菌脱纤维羊血购于广州鸿泉生物科技有限公司。药敏试验结果判断标准参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2020年标准[6]。

1.2.2mtrR基因扩增测序 选取对阿奇霉素非敏感的菌株(阿奇霉素非敏感组，MIC>1.000 μg/mL)和随机挑选的10株对阿奇霉素敏感的菌株(阿奇霉素敏感组，MIC≤1.000 μg/mL)进行基因组DNA提取，采用天根生物有限公司的基因组提取试剂盒，提取DNA后经核酸蛋白检测仪确认DNA浓度和纯度后保存于-20 ℃冰箱备用。参考文献[7]，由上海生工生物有限公司合成引物(mtrR-F:5′-GCCAATCAACAGGCATTCTTA-3′;mtrR-R:5′-GTTGGAACAACGCGTCAAAC-3′)。PCR试剂盒购于Promega公司，反应体系参考试剂说明书，mtrR基因的扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；然后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳获取PCR产物后，送至上海生工生物有限公司进行测序。

1.3统计学处理 采用Bioedit软件对测序结果进行分析，利用ORF Finder进行阅读框架的翻译；采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1药敏试验结果 43株菌株中共检出对阿奇霉素非敏感的菌株11株，对阿奇霉素敏感的菌株32株，阿奇霉素的非敏感率为25.6%(11/43)，其MIC结果见表1。

表1 淋病奈瑟菌对阿奇霉素的MIC结果

2.2mtrR基因的检出情况及突变特点 选择的21株菌株(11株对阿奇霉素非敏感，10株对阿奇霉素敏感)均扩增出mtrR基因，部分标本琼脂糖凝胶电泳结果见图1。其中阿奇霉素非敏感组在mtrR启动子区13 bp反向重复序列中A碱基缺失突变的比例为45.5%(5/11),而阿奇霉素敏感组A碱基缺失突变的比例为70.0%(7/10),两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。阿奇霉素非敏感组在mtrR编码区发生突变的比例为54.5%(6/11,分别为菌株18010080、18011026、18015369、20014066、20018372、20019431)。阿奇霉素敏感组在mtrR基因编码区发生突变的比例为50.0%(5/10，分别为菌株18015432、19003706、19015308、20006226、20007603)，两组之间差异无统计学意义(P>0.05)，但可见阿奇霉素非敏感组在mtrR基因编码区存在多个位点的突变。见表2。

注：M为标志物；1～10分别为菌株18006276、18009808、18010080、18011026、18015369、18015432、19003706、19008415、19012656、19014501。

表2 mtrR基因突变情况

续表2 mtrR基因突变情况

3 讨 论

淋病是由淋病奈瑟菌引起的一类性传播疾病，男性的临床表现为尿道炎，女性则表现为宫颈炎，严重者可导致盆腔炎、不孕症及异位妊娠等不良后果。同时，淋病奈瑟菌感染还可能增强人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染和传播[8]。2014年欧洲疾病预防控制中心的报告显示，在2013—2014年淋病奈瑟菌的感染率增长了25%[1]，由于目前还没有针对淋病的疫苗，对淋病的控制主要依赖于流行病学监测和抗菌药物的使用[9]。为提高治疗效果，许多国家推荐采用头孢曲松联合阿奇霉素作为无并发症淋病的一线治疗药物[10]。然而阿奇霉素耐药菌株，特别是高度耐药菌株已经时有报道，大大降低了联合用药的有效性。因此，监测淋病奈瑟菌对阿奇霉素的耐药性，了解其耐药机制，将有利于预防淋病奈瑟菌的传播，延缓耐药性的发生。本研究中的43例菌株对阿奇霉素的非敏感率为25.6%，MIC最大值可达64.000 μg/mL。临床应重视淋病奈瑟菌的耐药性，根据药敏试验结果进行治疗用药的选择。

阿奇霉素是大环内酯类药物，主要通过与细菌核糖体50S亚基的23S rRNA结合，干扰信使核糖核酸(mRNA)翻译，通过阻断转肽酶的作用，从而抑制细菌蛋白质的合成。研究表明，淋病奈瑟菌对阿奇霉素的耐药机制主要涉及两个方面：一个是药物外排的加强，另一个是药物靶点的改变。其中药物外排的加强主要是由于mtrR基因发生突变导致。mtrR基因编码mtrR蛋白，此蛋白可以负向调控外排泵，当mtrR基因发生突变时，可以引起mtrR蛋白减少或缺失，从而导致细菌外排抗菌药物的能力增强，使得细菌对阿奇霉素的敏感性下降[11]。有研究表明，mtrR基因启动子区域的A碱基缺失突变与阿奇霉素的MIC提高有关[12]，而mtrR基因编码区发生的G45D替换突变也与细菌对阿奇霉素高度耐药有关[13]。本研究中阿奇霉素非敏感组和阿奇霉素敏感组中均出现A碱基缺失突变，两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。而与阿奇霉素敏感组比较，阿奇霉素非敏感组在mtrR基因编码区可见多个位点的突变,这与文献[14]报道相似。但编码区的替换突变在两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，可能的原因是淋病奈瑟菌对阿奇霉素的耐药机制除了mtrR基因突变作用之外，还与23S rRNA基因突变密切相关，此外rpID、rpIV等基因突变也可导致细菌的耐药性升高[15]。不同的mtrR基因突变方式对淋病奈瑟菌的耐药性所起的作用也可能不同[16]，有研究表明，mtrR基因启动子区发生的缺失突变在淋病奈瑟菌对阿奇霉素耐药性中起的作用比mtrR基因编码区发生的替换突变更为重要[17]。

综上所述，淋病奈瑟菌对阿奇霉素的耐药形势较为严峻，mtrR基因发生突变可以使淋病奈瑟菌产生耐药性，临床应该重视阿奇霉素的敏感性监测及mtrR基因检测，并根据药敏试验结果合理选择抗菌药物，制订合理措施来控制淋病奈瑟菌的播散。