产ESBLs及非产ESBLs大肠埃希菌耐药性及多位点序列分型*

麦杏连，刘思瑶，肖婷婷，邓淑妃，何倩君，张中文，温伟洪，徐令清△

广州医科大学附属第六医院/广东省清远市人民医院：1.药学部；2.检验科，广东清远 511518

大肠埃希菌(ECO)属于革兰阴性杆菌，是临床常见条件致病菌之一，当机体抵抗力下降时该菌可引起多种疾病，且该菌耐药机制复杂，在全世界广泛流行。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)微生物首次发现于人体，后来人们发现其也存在于环境中和动物体内[1]。临床治疗革兰阴性菌的首选药物是碳青霉烯类抗菌药物，该药也是抵抗多重耐药ECO感染的最后一道防线[2]。近年来，由于抗菌药物的滥用，导致耐药基因相互传播，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)逐渐增多，耐药率明显升高，院内感染率急剧上升[3]。全球感染CRE的大多为成人，儿童患病较少[4]。

多位点序列分型(MLST)是一种标准分子分型技术[5]，分辨率高、重复性好，可检测多个管家基因序列获得基因分型，目前用于细菌等病原体流行病学研究。分析结果用序列分型(ST)表示，不同菌株ST存在差异，遗传相关性不同，因此可比较细菌等位基因多样性。本研究采用MLST技术对本院临床分离的89株产ESBLs和非产ESBLs ECO进行ST，分析耐药性差异，为院内感染防治提供流行病学依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院2018年1—12月ECO 89株，其中产ESBLs 48株，非产ESBLs 41株，剔除重复菌株。以铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923及ECO ATCC25922作为质控菌株。

1.2仪器与试剂 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS，布鲁克道尔顿公司)；BD phoenix M50全自动细菌鉴定仪(美国BD公司)；T 100TMPCR扩增仪和电泳仪(美国BIO-RAD公司)；Gel DoxTMXR+紫外凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。头孢他啶，头孢他啶/克拉维酸，头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸纸片(英国Oxoid 公司)；Tiangen 细菌DNA提取试剂盒，Taq PCR Master Mix、GelRed核酸染料和Marker Ⅱ DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)；哥伦比亚血琼脂平板(广州市迪景科技有限公司)；引物(广州生工生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1药敏试验与鉴定 采用BD phoenix M50全自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定及药敏试验，质谱仪进行复核。

1.3.2ECO DNA提取与MLST 从-80 ℃冰箱取出菌株并复苏，转种至血平板，放置孵箱过夜培养，挑取定量菌落，加入200 μL无菌生理盐水制成悬液，按DNA提取试剂盒说明书提取DNA，将洗脱后的DNA产物置于1.5 mL无菌EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。7对管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)按文献[6]设计，引物序列及退火温度见表1。PCR反应体系为25.0 μL：无菌纯水10.5 μL，2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 1.0 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min；5 ℃变性1 min；退火1 min；72 ℃延伸2 min；30个循环，最后72 ℃延伸5 min。取5.0 μL PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，5.0 μL 100～1 200 bp Marker Ⅱ DNA Ladder为参照，电压100 V下电泳10 min然后60 V电泳 40 min，电泳后凝胶系统成像，观察电泳条带结果。PCR产物送往上海生工生物工程技术有限公司进行纯化和测序。

表1 MLST 7对管家基因引物序列及退火温度

1.3.3序列比对及MLST数据分析 将产物测序结果上传至网站(http://mlst.warwick.ac.uk /mlst/dbs/Ecoli)进行分析，获得对应等位基因号，基于ECO 7对管家基因进行MLST数据分析，获得对应ST，利用网络软件对MLST数据进行分析。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1临床标本分布情况 48株产ESBLs菌株：泌尿外科8株，胃肠外科7株，肝胆外科6株，重症监护室(ICU)和妇科各5株，其余标本来自其他科室。41株非产ESBLs菌株：泌尿外科12株，肝胆外科8株，其余标本来自其他科室。

2.2药敏试验与质谱鉴定 48株产ESBLs ECO和41株非产ESBLs ECO耐药率比较结果见表2，产ESBL ECO对大部分抗菌药物的耐药率显著高于非产ESBL ECO(P<0.05)。质谱结果与BD phoenix M50全自动细菌鉴定仪鉴定结果完全一致，符合率为100%。

表2 48株产ESBLs和41株非产ESBLs ECO耐药率比较(%)

2.37对管家基因PCR扩增结果 对89株菌株的7对管家基因进行PCR扩增和产物电泳，结果显示，7对管家基因PCR扩增菌株均出现电泳条带，并与预期片段长度583～932 bp相同，见图1。

注：M为MarkerⅡ DNA Ladder；1～7分别为adk、fumC、icd、purA、gyrB、mdh、recA。

2.4MLST结果 将89株ECO 7对管家基因PCR扩增后的测序结果上传至网站，与对应的等位基因谱(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)比对得到每个菌株等位基因号，并将等位基因号与对应管家基因进行比对分析。89株ECO共获得45种ST：产ESBLs ECO 24种，其中ST131型9株，ST1193型6株，其他型别散在分布； 非产ESBLs ECO 21种，其中ST95型7株，ST69型4株，其他型别散在分布。

3 讨 论

ECO是目前临床最常见的条件致病菌之一，近年来抗菌药物的滥用导致该菌耐药率逐年上升，出现多重耐药和泛耐药ECO，如产ESBLs ECO。ESBLs对广谱头孢菌素有较强抵抗性，而对喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物有交叉耐药性。

MLST是一种具有高分辨率的技术，通过测定细菌基因组管家基因序列来比对基因分型数据，属于分子生物学方法。与电泳条带分型方法比较，MLST分析结果准确，具有较强的可比性和重复性，能准确提供菌株不同型别，用于世界多地区细菌分子分型的流行病学研究。

本研究对89株ECO进行MLST，结果显示89株ECO共有45种ST。产ESBLs ECO为24种，主要是ST131型和ST1193型，其他型别散在分布；非产ESBLs ECO为21种，主要是ST69型和ST95型，其他型别散在分布。本研究结果表明，ST69型、ST95型、ST131型和ST1193型为本院ECO主要型别，而BIRGY等[7]报道ECO的ST以ST69、ST95、ST131、ST1193、ST38、ST73、ST405、ST12为主。本研究中ST69型占4.5%(4/89，4株全部为非产ESBLs ECO)；ST95型占10.1%(9/89，其中产ESBLs ECO 2株，非产ESBLs ECO 7株)；ST131型占13.5%(12/89,其中产ESBLs ECO 9株，非产ESBLs ECO 3株)；ST1193型占10.1%(9/89，其中产ESBLs ECO 6株，非产ESBLs ECO 3株)。MATSUI等[8]认为ST69、ST95、ST1193型是共享基因型，最常见于尿液标本分离的ECO，属于流行性肠外致病ECO谱系。

有研究者对产ESBLs ECO的ST69型菌株导致的肾盂肾炎进行治疗，但以失败告终[9]。ST131型ECO具有毒力因子和高致病性，适应力强，与细菌耐药有关。近期有研究在检测一位74岁女性患者肠道时发现ST131型ECO菌株[10]。ST1193型ECO于2012年在澳大利亚发现，2013又在法国一位囊性纤维化患者中发现[11-12]。ST1193型也是一种新兴家族氟喹诺酮耐药ECO的基因型，在多个国家有过报道[13-14]。

本研究的ECO菌株分布情况显示，它们来自临床不同科室，型别较散乱，无法判断某型别是否为该科室流行菌株，但较多来自泌尿外科。产ESBLs尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)入侵尿道黏膜可导致尿路感染(UTIs)，UTIs在医院获得性感染性疾病中排第2位，仅次于呼吸道感染，可引起严重症状，病死率高，是临床常见感染性疾病之一，给医疗卫生行业带来极大的挑战。BADER等[15]发现阿莫西林/克拉维酸可治疗尿路感染，能抑制ESBLs，抵抗产ESBLs ECO感染。但阿莫西林/克拉维酸治疗产ESBLs ECO引起的感染目前在学术界存在争议，应在药敏试验中检测有效后才可用于临床治疗。

药敏试验结果显示，89株ECO中，48株产ESBLs ECO对头孢类抗菌药物耐药率高，对酶抑制剂抗菌药物有较好的敏感率，对美罗培南、亚胺培南敏感率高。而41株非产ESBLs ECO对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星和头孢类抗菌药物有较高的敏感率，可考虑对感染非产ESBLs ECO患者使用此类药物治疗。

无论是产ESBLs ECO还是非产ESBLs ECO，都会给患者带来一定危害。在治疗方面，产ESBLs ECO感染患者可能要经历更漫长的治疗过程，而非产ESBLs ECO是引起医院感染的常见致病菌，同时也可长期定植于人体或医院环境中，并通过不同的感染途径在院内传播，引起院内耐药株流行及院内感染播散。在早期都应考虑给予β-内酰酶抑制剂及碳青霉烯类抗菌药物治疗，待感染控制后，再进行降阶治疗。为防止出现院内感染大暴发，应对CRE的预防和控制予以重视，加强易感因素及细菌耐药性监测，加强院内各科室的消毒隔离工作及医护人员管理，阻断一切可能的传播途径，切实控制院内感染的发生和流行。