幽门螺杆菌阳性胃黏膜病变和胃癌中miR-93的表达及与临床病理特征的相关性研究

白忠秀，王 艳，孟红军

幽门螺杆菌(H.pylori)携带者慢性浅表性胃炎(CSG)、慢性萎缩性胃炎(CAG)及肠上皮化生(IM)风险增高，胃癌(GC)患者中H.pylori阳性比例也较高[1]。有研究认为，H.pylori感染是胃黏膜癌前病变发展为GC的重要诱发因素[2]，但机制尚不清楚。miRNA在肿瘤恶性行为中具有重要的调控作用，介导恶性肿瘤的发生及发展。有研究显示，miRNA及其靶基因是H.pylori相关病变的重要调控因子[3]。miR-93在胃癌组织中表达上调[4]，但在H.pylori不同状态下miR-93表达程度可能不同。本研究检测miR-93在H.pylori不同状态下GC、CSG、CAG和IM等胃黏膜病变中的表达水平，并分析H.pylori不同状态下GC中miR-93与临床病理特征的关系，目的在于评价miR-93在H.pylori阳性GC中的表达及意义，为进一步探讨miR-93与H.pylori在胃癌发生及发展中的作用及机制提供前期实验数据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年1月—2019年6月我院CSG患者12例、CAG患者12例、IM患者12例及GC患者23例胃镜标本，23例GC均经过手术治疗。病变组织中H.pylori阴性及阳性例数分别为CSG(5/7)、CAG(6/6)、IM(4/8)及GC(8/15)。GC患者术中切取0.5 cm3肿瘤组织及距离肿瘤2 cm以上的癌旁正常组织,置于液氮罐中保存。本研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2研究方法

1.2.1细胞培养：低分化胃癌细胞HGC-27及胃正常黏膜上皮GES-1细胞(购自中科院上海细胞库)采用贴壁培养，在沈阳医学院科学试验中心进行培养及传代。选择生长数量>5×105的原代细胞进行传代。细胞培养条件为5% CO2、95%空气、37 ℃。

1.2.2H.pylori感染HGC-27细胞及GES-1细胞：H.pylori标准菌株NCTC11637购自美国ATCC，0.2～0.5 ml培养液溶解活化细菌冻干粉，后接种在2个平板上进行复苏，培养基为改良布氏培养基，培养条件为10% CO2、3%～5% CO2、37 ℃。取融合度75%以上的对数生长期细胞，以细胞︰菌落为1︰100的比例感染各组细胞，未感染细胞为对照组，继续培养24 h后行qRT-PCR检测miR-93表达。

1.2.3qRT-PCR检测:采用qRT-PCR试剂盒进行miR-93检测。首先处理组织及细胞后按照试剂盒说明书进行总RNA抽提，并进行纯度及完整性检验，绘制标准曲线DNA模板，配置PCR反应液，应用RT-PCR仪进行扩增，以2-ΔΔCT法进行溶解曲线分析。

1.2.4相关性分析：采集GC患者临床病理参数，分析H.pylori不同状态下胃癌组织miR-93相对表达量与临床病理参数的相关性。

2 结果

2.1生物信息学分析miR-93表达与GC的相关性 生物信息学分析显示miR-93在GC组织中表达高于癌旁正常组织，为GC正相关基因，且相关性极强，经P值校正后FDR<0.01，miR-93在ID-73524与ID-72398数据集中表达差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 生物信息学分析miR-93与胃癌的相关性柱状图及热图

2.2miR-93在H.pylori不同状态下胃黏膜病变及GC组织中的表达 H.pylori阳性状态下较阴性状态下CSG、CAG、IM及GC组织miR-93表达上调(P<0.05，P<0.01)。组间比较，H.pylori阳性状态下，GC组织miR-93表达高于CSG、CAG及IM组织(P<0.01)，IM组织miR-93表达高于CSG组织(P<0.01)；H.pylori阴性状态下，GC组织miR-93表达高于CSG、CAG及IM组织(P<0.05，P<0.01)，IM组织miR-93表达高于CSG组织(P<0.01)。见图2。

图2 miR-93在H.pylori不同状态下CSG、CAG、IM及GC组织中的表达CSG为慢性浅表性胃炎，CAG为慢性萎缩性胃炎，IM为肠上皮化生，GC为胃癌，H.pylori为幽门螺杆菌；与H.pylori阴性比较，aP<0.05,bP<0.01；与GC组织H.pylori阳性比较，cP<0.01;与IM组织H.pylori阳性比较，dP<0.01；与GC组织H.pylori阴性比较，eP<0.05,fP<0.01；与IM组织H.pylori阴性比较，gP<0.01

2.3H.pylori不同状态下GC组织与癌旁正常组织中miR-93的表达 H.pylori阳性GC组织miR-93表达显著高于癌旁正常组织(P<0.05)，见图3A；H.pylori阴性GC组织miR-93表达与癌旁正常组织比较无差异(P>0.05)，见图3B。

图3 H.pylori不同状态下胃癌组织与癌旁正常组织中miR-93的表达情况H.pylori为幽门螺杆菌

2.4H.pylori不同状态下GC组织miR-93表达与临床病理参数的相关性 TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移阳性、浸润深度T3+T4、低+未分化的H.pylori阳性GC组织中miR-93表达要高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、淋巴结转移阴性、浸润深度T1+T2、高+中分化的H.pylori阳性GC组织(P<0.01)。见表1。

表1 H.pylori不同状态下胃癌组织miR-93表达与临床病理参数相关性

2.5H.pylori对GC细胞miR-93表达的影响 为探讨miR-93与H.pylori阳性GC的关系，我们观察了H.pylori干预下低分化GC细胞HGC-27及胃正常黏膜上皮细胞GES-1中miR-93表达水平，结果显示，H.pylori干预下HGC-27细胞及GES-1细胞中miR-93表达均上调(P<0.01)，见图4。

图4 H.pylori干预下胃癌细胞HGC-27及正常胃黏膜细胞GES-1中miR-93表达变化H.pylori为幽门螺杆菌；与H.pylori阳性比较，aP<0.01

3 讨论

GC在消化系统肿瘤中较常见，发病率及病死率均呈上升趋势，H.pylori为GC重要的致病因素，其诱发机制是目前研究的热点[5]。CAG患者癌变率较高，H.pylori携带率也高[6]。IM是癌前病变，有研究显示该类患者H.pylori阳性率极高[7]。慢性胃炎、CAG及IM可能是胃黏膜病变到GC的演化过程，而H.pylori在这个过程中的作用及机制目前并不明确[8]。miR-93在多种恶性肿瘤组织及细胞中表达高于癌旁正常组织[9]，GC组织中miR-93的表达与其他实体瘤相似，调控癌细胞增殖、侵袭及凋亡等恶性行为[10]。但目前H.pylori不同状态下GC组织中miR-93表达的相关研究较少。

本研究首先通过TCGA生物信息学分析了miR-93在GC组织中的表达高于癌旁正常组织，提示miR-93为GC的促癌基因。为进一步分析miR-93与胃黏膜病变及癌性病变的关系，本研究观察H.pylori不同状态下miR-93在胃黏膜病变(CSG、CAG及IM)组织中的表达情况，结果显示在H.pylori阳性以上病变组织中miR-93表达均上调，随着黏膜病变的加重miR-93表达呈上升趋势，而在H.pylori阴性状态下这种趋势不明显。LIU等[11]研究显示，miR-30a可促进H.pylori相关GC的进展。miR-122在H.pylori阳性或阴性GC组织中表达均上调[12]。另有研究认为，miR-155能抑制H.pylori阳性胃炎向GC的发展过程[13]。这些研究均表明，H.pylori感染能影响胃黏膜miRNA表达水平，进而促进或抑制胃黏膜病变的进展。本研究进一步显示，在H.pylori阳性GC组织中miR-93表达显著高于癌旁正常组织，而在H.pylori阴性的GC组织中这种差异并不明显。而且在H.pylori阳性与阴性GC组织中，miR-93表达在TNM分期、淋巴结转移、浸润深度及分化程度方面具有明显差异。QU等[14]研究显示，miR-490-3p在H.pylori阳性GC组织中表达下调，与不良临床病理特征具有相关性。这也说明，是否存在H.pylori感染对miRNA在GC组织中的表达及功能具有调控作用。为进一步验证miR-93与H.pylori感染有关，本研究通过细胞实验观察在H.pylori干预下，GC HGC-27细胞及正常胃上皮GES-1细胞miR-93表达的差异，结果显示H.pylori干预下细胞miR-93表达上调，表明H.pylori可能影响GC细胞或胃上皮细胞中miR-93的表达。SHAO等[15]研究认为，H.pylori通过诱导miR-135b-5p表达抑制GC细胞凋亡及诱导顺铂耐药。XIE等[16]研究显示，H.pylori通过抑制GC细胞miR-152及miR-200b表达促进GC细胞免疫逃逸。以上研究均支持H.pylori相关GC与H.pylori诱导的miRNA表达具有调控关系。

总之，miR-93在H.pylori阳性胃黏膜病变、GC组织及细胞中表达上调，与GC不良临床病理特征具有一定相关性。