重组人粒细胞刺激因子促进骨髓间充质干细胞修复急性肺损伤的机制研究

乔广明，王志敏，张雪欣，时亚娟，齐晓玉，贠美玲，岳智杰

急性肺损伤是多种因素引起的急性弥漫性肺损伤，病情严重时可能会出现急性呼吸窘迫综合征[1]。急性肺损伤发病可能与细胞凋亡、炎症反应等有关[2]。目前急性肺损伤的治疗方式包括药物治疗、机械通气，但病死率仍较高[3]。重组人粒细胞集落刺激因子是干细胞动员剂，能促进干细胞及造血祖细胞生长、分化和成熟，对干细胞移植具有重要作用[4]。有研究发现，重组人粒细胞集落刺激因子能有效减缓肺损伤的炎症反应[5]。骨髓间充质干细胞是一种多功能细胞，具备成骨细胞、神经细胞等多种细胞的分化能力[6]。研究显示，骨髓间充质干细胞移植能减缓急性肺损伤大鼠的炎症反应[7]。故本研究通过构建急性肺损伤模型，探讨重组人粒细胞刺激因子促进骨髓间充质干细胞修复急性肺损伤的机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 重组人粒细胞刺激因子购自广州拜迪生物医药有限公司；TUNEL试剂盒购自罗氏公司；p53抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和GAPDH抗体购自英国Abcam公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒、IL-10试剂盒购自R&D公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物和分组 实验动物选择清洁级BALB/C小鼠，4～6周龄，体质量18～22 g，购自北京华阜康生物公司，许可证号为SYXK(京)2014-0004。开始实验前7 d，小鼠正常饮食和进水。

1.3骨髓间充质干细胞制备 选择5只小鼠称取体质量，然后腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉处死小鼠，无菌条件下取出小鼠胫骨、股骨，除去肌肉、结缔组织等，取出骨髓用PBS液冲洗并制成细胞悬液，1000 r/min离心5 min，后放置在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素与0.1 g/L链霉素的DMEM培养基内，1×108/ml密度接种于25 cm2培养皿，在37 ℃、5% CO2条件下培养。观察细胞生长状态至85%时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

1.4实验分组和给药 将60只BALB/C小鼠均分为对照组、模型组、治疗组、干细胞组、联合组。除对照组外均予腹腔内注射5 mg/kg脂多糖建立急性肺损伤模型[8]，对照组注射等体积生理盐水。造模成功24 h后，对小鼠进行不同处理，治疗组：尾静脉注射50 μg/kg重组人粒细胞刺激因子；干细胞组：尾静脉注射1 ml骨髓间充质干细胞悬液(3×106个)；联合组：尾静脉注射50 μg/kg重组人粒细胞刺激因子和1 ml骨髓间充质干细胞悬液(3×106个)。各组治疗72 h后，观察小鼠精神状态、呼吸、饮食和进水等一般情况。

1.5肺组织湿/干比测定 给药72 h后，用3 mg/kg 10%水合氯醛麻醉小鼠，取出小鼠左肺组织使用滤纸吸干表面血液后称重，然后在80 ℃烘箱内停留24 h并称重，计算二者比值。

1.6TUNEL检测肺组织细胞凋亡情况 取出麻醉处死小鼠肺组织，用4%多聚甲醛固定12 h，脱水石蜡包埋切片，切片厚度约6 μm，严格参照TUNEL试剂盒说明书进行操作并观察细胞凋亡情况。

1.7ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平 处死小鼠后取小鼠外周血2 ml，离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书，检测各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平。

1.8Western blot法检测肺组织p53、Bax、Bcl-2蛋白表达 取上述肺组织，加入蛋白裂解液后提取细胞蛋白，离心后采用BCA法进行蛋白定量。取蛋白样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的样品转移至膜上，经脱脂奶粉封闭培养1 h，加入p53抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和GAPDH抗体于4 ℃孵育过夜，加入带有标记的二抗，37 ℃孵育1 h，滴加ECL发光液显色，以GAPDH为内参，收集图像分析蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1各组小鼠一般情况 对照组小鼠精神状态较好、正常饮食和进水，无死亡；模型组小鼠精神状态较差、呼吸较为困难、饮食和进水减少，存活5只，存活率为41.7%；治疗组、干细胞组和联合组小鼠精神状态、饮食和进水欠佳，分别存活9只、10只、11只，存活率分别为75.0%、83.3%、91.7%。

2.2各组肺组织湿/干比、细胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平比较 与对照组相比，模型组、治疗组、干细胞组、联合组肺组织湿/干比、细胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA水平明显升高，SOD水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，治疗组、干细胞组、联合组肺组织湿/干比、细胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA水平明显降低，SOD水平明显升高(P<0.05)；与治疗组、干细胞组相比，联合组肺组织湿/干比、细胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA明显降低，SOD明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺组织湿/干比、细胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平比较

2.3各组小鼠肺组织p53、Bax、Bcl-2蛋白表达比较 与对照组相比，模型组、治疗组、干细胞组、联合组p53、Bax蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)；与模型组相比，治疗组、干细胞组、联合组p53、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)；与治疗组、干细胞组相比，联合组p53、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)。见图1和表2。

图1 各组小鼠肺组织p53、Bax、Bcl-2蛋白表达

表2 各组小鼠肺组织p53、Bax、Bcl-2蛋白表达比较

3 讨论

脂多糖是建立急性肺损伤动物模型的关键诱因，能促进肺组织活性氧产生大量细胞因子，造成肺组织损伤[9]。本研究采用脂多糖建立急性肺损伤动物模型，且其肺组织湿/干比明显增加，并促进了肺组织细胞凋亡，血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA分泌增加，SOD分泌降低，p53、Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，证明模型构建成功。

重组人粒细胞刺激因子不仅可用于治疗癌症化疗后粒细胞减少，还能用于造血干细胞移植、白血病治疗等方面[10]。陆鹏和方小正[11]研究显示，重组人粒细胞刺激因子能有效减轻肺损伤大鼠模型炎症反应，减缓炎性细胞浸润，对肺损伤具有一定保护作用。宋静和张蕴萍[12]通过建立内毒素诱导的急性肺损伤大鼠模型，发现重组人粒细胞刺激因子能促进急性肺损伤大鼠肺泡表面物质再生，减缓炎症反应和肺组织细胞凋亡。本研究显示，与模型组相比，治疗组肺组织湿/干比、细胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA明显降低，SOD明显升高，p53、Bax蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调，说明重组人粒细胞刺激因子治疗急性肺损伤有一定效果。

骨髓间充质干细胞能分泌多种生长因子，具有多向分化、造血、促进干细胞移植等功能，是组织功能的种子细胞[13]。骨髓间充质干细胞移植能改善脂多糖诱导的肺损伤大鼠血气分析指标，抑制肺组织炎性因子分泌[14]。周航等[15]研究结果显示，骨髓间充质干细胞能减缓肺损伤小鼠肺组织细胞凋亡，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌。本研究结果显示，骨髓间充质干细胞能降低急性肺损伤模型小鼠肺组织湿/干比、细胞凋亡率、MDA水平，抑制TNF-α、IL-1β、IL-10炎性因子分泌，并促进SOD活性，p53、Bax蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调，说明骨髓间充质干细胞具有保护急性肺损伤的作用。重组人粒细胞刺激因子不仅能促进干细胞释放，还能修复损伤组织[16]。本研究还发现，与单一重组人粒细胞刺激因子和骨髓间充质干细胞干预比较，联合组能进一步降低模型小鼠肺组织湿/干比、细胞凋亡率、MDA，抑制TNF-α、IL-1β、IL-10分泌，增加SOD活性，下调p53、Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，说明二者联合应用效果优于单一治疗。

综上，重组人粒细胞刺激因子和骨髓间充质干细胞联合治疗急性肺损伤模型小鼠的效果优于单一治疗，能减少小鼠肺组织细胞凋亡，并减轻炎症反应和氧化反应，对急性肺损伤具有保护作用。