基于基线等比增减设计法优选牛膝白芍对帕金森病肝阳上亢证小鼠神经保护作用的最佳配比研究

张静艳 郭科东 金 明 荣 华 张晓杰

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是中老年人群常见的神经系统退行性疾病，以肌肉强直、静止性震颤等症状为主要临床表现，其发生率逐年上升，严重威胁人类健康[1]。PD的治疗目前以外源性补充多巴胺(dopamine，DA)为主，虽然能够改善疾病的症状，但由于缺乏神经保护作用，不能阻止神经元的变性、疾病进展及致残。因此需要进一步研究有效治疗PD的潜在新疗法[2，3]。

镇肝熄风汤记载于《医学衷中参西录》,临床用于肝肾阴亏、肝阳上亢型PD疗效显著[4]。但大复方药味复杂，不同成分叠加后的作用难以预测。牛膝与白芍是镇肝熄风汤的核心药对，是治疗帕金森病方剂中出现频率较高的单味中药，且笔者课题组前期细胞实验已经证实，牛膝与白芍有效组分配伍对PD多巴胺能神经元具有协同保护作用，但其配伍的体内研究尚未有报道[5，6]。本实验提取镇肝熄风汤的君药牛膝和臣药白芍为核心药对，以基线等比增减设计法为基础，牛膝与白芍2∶1为基线向两侧扩展，直至扩大到极点(0∶4、4∶0)，最后形成牛膝与白芍 0∶4、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、4∶0配比组，探索其在体内发挥神经保护作用的最佳配伍比例[7]。

材料与方法

1.实验材料：8周龄C57BL/6雄性小鼠90只，体质量为22±2g，由维通利华(北京)实验动物科技有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。附子(D4120201)购自黄冈金贵中药发展有限公司，怀牛膝(801000130)、白芍(801001062)均购自北京同仁堂饮片有限公司，分别以相应比例混合。所有药材按传统煎药法制成含生药附子0.2g/ml、牛膝白芍0.5g/ml药液。MPTP(M 0896)购自美国Sigma公司，兔抗鼠TH抗体(2792S)购自美国CST公司,β-actin抗体(4967S)购自美国CST公司，羊抗兔IgG抗体(BA1054)购自武汉博士德生物工程公司。

2.动物分组、造模及给药：小鼠采用数字表法随机分为对照组、模型组、牛膝白芍不同配比组，共9组，每组10只。除对照组外，各组小鼠给予附子汤[3g/(kg·d)]灌胃4周制备肝阳上亢证动物模型[8]。灌胃结束后，牛膝白芍不同配比组连续14天灌胃相应比例药物[6.5g/(kg·d)，按小鼠平均体质量23g计算即每天每只小鼠给药量为150mg]，对照组、模型组给予等体积蒸馏水。于给予治疗药物第10天开始，模型组、牛膝白芍不同配比组小鼠腹腔注射MPTP[30mg/(kg·d)]连续5天制备PD肝阳上亢证结合模型[9]。灌胃及腹腔注射过程中死亡的小鼠直接予以剔除。

3.小鼠易激惹程度观察及评分：Ⅰ级：捉持小鼠头颈时出现尖叫、惊跳；Ⅱ级：捉持小鼠头颈时咬人；Ⅲ级：小鼠被提尾时尖叫、惊跳或与同笼小鼠厮斗。Ⅰ～Ⅲ级均不出现者为0级，实验结束前测量1次[10]。

4.转棒实验检测小鼠协调平衡能力：转棒仪起始转速为4r/min，最大转速为40r/min，加速度为0.12r/min，测试时间为5min，记录小鼠在转棒上停留的时间，即掉落潜伏期[11]。

6.免疫组化法分析TH阳性神经元平均光密度：黑质区石蜡包埋切片，进行脱蜡、抗原修复、封闭。PBS漂洗后滴加按1∶200稀释的TH一抗。PBS清洗后滴加二抗(1∶100),进行DAB显色，苏木精复染,PBS返蓝，脱水封片。使用Image-Pro Plus 6.0软件测定TH阳性蛋白的表达,根据其累积吸光度计算各组的平均吸光度(MOD)。

7.Western blot法检测黑质TH蛋白表达：冰上取鼠脑黑质，BCA法进行蛋白定量，SDS凝胶电泳，转膜，封闭，加入TH抗体(1∶1000)4℃过夜；二抗(1∶6000)孵育；TBST清洗后进行ECL化学发光反应，凝胶成像系统显影，并用AlphaEase FC图像分析软件对免疫印迹条带进行密度扫描，以TH/β-actin比较各组蛋白相对表达水平。

结 果

1.小鼠易激惹程度的比较:与对照组比较，模型组小鼠易激惹程度明显升高(P<0.05)；与模型组比较，牛膝白芍1∶4、1∶2、1∶1、2∶1组小鼠易激惹程度明显降低(P<0.05)，而牛膝白芍0∶4、4∶1、4∶0组小鼠易激惹程度差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 小鼠易激惹程度的比较

2.小鼠转棒掉落潜伏期的比较:与对照组比较，模型组小鼠掉落潜伏期明显缩短(P<0.05)；与模型组比较，牛膝白芍各配比组小鼠掉落潜伏期明显延长(P<0.05，表2)。

表2 小鼠转棒掉落潜伏期的比较

3.联合指数法对牛膝与白芍联用协同作用的分析:等效线图显示所有配比组联合用药数据点均在等效线下方，CI值均<1，提示两药在不同比例配伍时均具有协同增效作用。其中在牛膝与白芍以1∶2比例配伍时，联合指数(CI=0.860)最小，效应值(Fa=0.235)最大，即协同增效作用最佳(图1、表3)。

图1 牛膝白芍不同配比等效线图1.牛膝白芍1∶4组；2.牛膝白芍1∶2组；3.牛膝白芍1∶1组；4.牛膝白芍2∶1组；5.牛膝白芍4∶1组

表3 牛膝白芍不同配比联合指数及效应值

4.小鼠TH免疫组化结果比较:与对照组比较，模型组小鼠黑质TH平均吸光度值显著降低(P<0.01)；与模型组比较，牛膝白芍各配比组黑质TH平均吸光度值均明显增高(P<0.05或P<0.01)，而其中以牛膝白芍1∶2组增高更为明显(P<0.01，图2、表4)。

图2 各组小鼠TH表达水平(免疫组化法，×400)A.对照组;B.模型组;C.牛膝白芍0∶4组;D.牛膝白芍1∶4组;E.牛膝白芍1∶2组;F.牛膝白芍1∶1组;G.牛膝白芍2∶1组;H.牛膝白芍4∶1组;I.牛膝白芍4∶0组

表4 各组小鼠黑质TH平均吸光度比较

5.小鼠脑组织TH蛋白相对表达量的比较:与对照组比较，模型组小鼠黑质TH蛋白表达明显减少(P<0.01)；与模型组比较，牛膝白芍不同配比组小鼠黑质TH蛋白表达均明显增加(P<0.05)，而其中以1∶2组蛋白表达增加更为明显(P<0.01，图3)。

图3 各组小鼠脑组织TH蛋白相对表达水平A.TH免疫印迹图；B.TH统计直方图。与对照组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01

讨 论

PD发病的根本原因为黑质DA能神经元的进行性缺失，DA类药物替代疗法仍是西医临床常用的治疗手段。由于神经退行性疾病的治疗药物多具有一定的毒性及不良反应，中医药对PD的研究越来越受到广泛关注[14]。牛膝白芍是临床治疗帕金森病几十余首方剂的常用配伍药对，牛膝补益肝肾、引火下行，白芍滋阴生津、缓急止痉[15,16]。两药配伍，补肾柔肝，潜阳熄风。鉴于中药大复方药味的复杂性，药对的比例及作用难以在方剂中研究与确定，本实验在前期体外研究的基础上，设计牛膝与白芍的不同配比，探讨其在体内发挥神经保护作用的最佳配伍比例。

动物实验证实，附子煎液灌服可制备PD肝阳上亢证模型[8]。附子辛温大热，久用耗伤精血，致肝肾阴虚、肝气上逆于脑，故鼠出现烦躁易怒(易激惹)症状。MPTP是PD研究中常用的神经毒素，可选择性损伤DA能神经元并诱导动物出现震颤、行动迟缓等行为[17]。本实验采用附子煎液灌服结合MPTP腹腔注射复制PD肝阳上亢证小鼠模型,小鼠激惹程度明显增高，并且出现弓背、抽搐、肌肉强直等症状，说明人类肝阳上亢型PD的症状在本实验中得到了较好的模拟。

易激惹实验结果表明，牛膝白芍1∶4、1∶2、1∶1、2∶1组小鼠易激惹程度较模型组明显降低，表明牛膝白芍两药以该比例配伍可使PD小鼠肝阳上亢症状得到较好的缓解。转棒实验结果表明，牛膝白芍各配比组小鼠掉落潜伏期均较模型组明显增加，表明牛膝白芍不同比例配伍均可使PD肝阳上亢证小鼠运动协调能力的损伤得到缓解。由于运动障碍是帕金森病的主要临床表现，本实验采用转棒行为学数据，应用Compusyn软件分析牛膝白芍不同比例配伍的联合作用。结果表明，牛膝白芍各比例配伍均具有协同作用，1∶2为其协同增效作用的最佳比例。

TH是脑内DA能神经元的特异性标志蛋白，其含量间接反映DA能神经元的损伤情况[18]。免疫组化及Western blot法实验检测结果显示，牛膝白芍各配比组TH阳性神经元及蛋白表达均较模型组明显增加，说明其可以有效减轻神经毒素对小鼠黑质DA能神经元造成的损伤，发挥神经保护作用，且以1∶2比例配伍时这种神经保护作用更加明显，这与由行为学实验计算的联合指数最佳配伍比例结果相一致。

综上所述，牛膝与白芍两药联用对PD肝阳上亢证小鼠DA能神经元具有协同增效的神经保护作用，1∶2为最佳配伍比例。笔者后续重点将围绕两药配伍后协同增效作用的机制展开研究，为其指导临床用药、精简复方提供更多的实验依据。