蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的稳定性

陈海燕，程仕群，胡腾鑫，郦明浩

广东产品质量监督检验研究院（佛山 528300）

蜜蜂在我国有着悠久的养殖历史，蜜蜂生产出的蜂蜜是人们日常生活中主动摄入糖的主要来源，同时又可以用于食物保存，因此在很早以前就被广泛使用[1-2]。蜂蜜作为治疗和保健食品，已有悠久的历史[3]。1 800年前，张仲景将蜂蜜用于治疗多种疾病，明代的李时珍在《本草纲目》中列举用蜂蜜治病的处方20余处[4]。现代医学证明，蜂蜜外用可以治疗冻伤、冻疮[5]，护唇及治疗口腔疾病、舒缓干燥，治疗皲裂、烧烫伤、蚊虫叮咬、皮肤溃疡、鼻炎[6]及外伤，养颜美容等[7-8]；蜂蜜内服可以缓解痛经[9]、治疗便秘和调节胃肠功能[10-12]、治疗支气管炎[13]、咳嗽[14]等。蜂蜜因多用途深受消费者喜欢，但天然蜂蜜成本高，部分不良商家以次充好来欺骗消费者牟取暴利[15-16]，天然蜂蜜中含有的化学物质主要为糖类，占蜂蜜质量的60~80 g/100 g[17-18]，蔗糖含量不得超过5 g/100 g，而部分不良商家主要是掺入糖类物质来冒充天然蜂蜜，因此准确测定蜂蜜中糖含量尤为重要[19-20]。

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的检测方法主要是GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》高效液相色谱法（high performance liquid chromatography HPLC）。按照GB 14963—2011《食品安全国家标准 蜂蜜》规定果糖和葡萄糖含量≥60 g/100 g，蔗糖含量≤5 g/100 g（野桂花蜜≤10 g/100 g），根据检测经验，不少蜂蜜产品果糖和葡萄糖含量在60±10 g/100 g，处于临界值附近，而对于果糖、葡萄糖、蔗糖这3种物质在蜂蜜中的稳定性研究尚少。试验从温度、水浴时间、pH等样品前处理研究3种糖在蜂蜜前处理过程中及样品处理后不同储存时间的稳定性，为试验过程中选取最优稳定性条件及最长储存时间进行相关物质测定时提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

果糖（99.70%，德国DR Ehrenstorfer公司）；葡萄糖（99.7%，美国TM Standard公司）；蔗糖（99.9%，中国北京坛墨质检科技有限公司）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；盐酸（分析纯，广州化学试剂厂）；氢氧化钠（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。

试样来自各大商超及农贸市场。

LC-20 AT高效液相色谱仪，配蒸发光散射检测器（日本岛津公司）；JJ500Y电子天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司）；EYELA SB-1100旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；IKA MS3漩涡混合器（德国IKA公司）；JP-0600超声波清洗机（广州吉普超声波电子设备有限公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；0.22 μm水系滤膜（天津津滕公司）；HH-8数显恒温水浴锅（常州市亿能实验仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

Shodex Asahipak NH2P-50 4E色谱柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流动相，80 g/100 g乙腈（A）-20 g/100 g水（B）；流速1.0 mL/min；进样体积20 μL；柱温40 ℃。蒸发光散射检测器条件：飘移管温度80~90 ℃；氮气压力350 kPa；撞击器为关。

1.2.2 单因素试验设计

1.2.2.1 温度对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

取7份样品，水浴温度分别为40，50，60，70，80，90和100 ℃，水浴30 min待蜂蜜晶体溶解。称取样品，用蒸馏水溶解稀释至合适的上机浓度过水系滤膜、上机检测。此条件下pH 7、水浴时间30 min，研究不同温度对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响。

1.2.2.2 水浴时间对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

取5份样品，水浴时间分别为20，30，40，50和60 min，水浴温度40 ℃，取样上机测试试样中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此条件下温度40 ℃、pH 7，研究不同水浴时间对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响。

1.2.2.3 pH对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

分别用1 mol/L盐酸和1 mol/L NaOH溶液调节pH，分别制成pH 2，5，7，9和12的溶液。取5份样品，分别用pH 2，5，7，9和12的溶液溶解别稀释释至合适的浓度过水系滤膜上机测定试样中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此条件下温度40 ℃、水浴时间30 min，研究不同pH对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响。

1.2.3 响应面优化设计

采用Box-Behnken模型，对影响蜂蜜果糖和葡萄糖、蔗糖含量的3个因素（温度、水浴时间、pH）进行优化设计，响应面试验因素水平详见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.2.4 储存时间对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

取11份样品，设定温度60 ℃，水浴30 min后用水溶解稀释至适合上机的浓度，室温放置0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8和9 d，取样上机测试试样中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此条件下室温温度25 ℃、pH 7，研究储存时间对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖稳定性的影响。

1.3 统计方法

每组试验均重复3次，结果取平均值。响应面设计及优化分析利用Design-Expert 8.0.6软件，显著性分析利用Excel 2003软件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制及试验检测

分别准确称取5.000 0 g果糖、葡萄糖、蔗糖，溶于水，移入5 mL容量瓶中，加一级水至刻度，混匀，此时溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖质量浓度1 000.0 mg/mL，用一级水继续稀释成质量浓度为500.0，200.0，100.0和50.0 mg/mL的标准使用液。过水系滤膜上机绘制标准曲线。标准图谱见图1，3种化合物的回归方程、线性范围及检出限标准曲线见表2。结果显示，试样样品中果糖质量分数为35.5 g/100 g，葡萄糖质量分数为30.4 g/100 g，蔗糖质量分数为1.88 g/100 g。

图1 果糖、葡萄糖、蔗糖标准品液相图谱

表2 果糖、葡萄糖、蔗糖回归方程、相关系数及检出限

2.2 单因素试验结果

2.2.1 温度对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数在40，50，60，70，80，90和100 ℃，水浴时间30 min，pH 7条件下处理结果见图2。

由图2可知：温度对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数稳定性有影响；果糖和葡萄糖、蔗糖这3种糖在温度60 ℃以上检出含量开始减少，温度越高，果糖和葡萄糖质量分数检出越少，因此，水浴蜂蜜中结晶时温度宜在60 ℃以下，考虑到水浴锅升高至60 ℃耗时耗能，故设置温度40 ℃。

图2 温度对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数的影响

2.2.2 水浴时间对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数在水浴时间20，30，40，50和60 min，温度40 ℃，pH 7条件下处理结果见图3。

由图3可知：水浴时间对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数稳定性有影响；果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数随着水浴时间的延长有减少趋势，因此选定水浴时间30 min。

图3 水浴时间对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数的影响

2.2.3 pH对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数在pH 2，5，7，9和12环境中处理结果见图4。

由图4可知：pH对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数稳定性有影响；在酸性和碱性环境下均为减少趋势，pH 7环境下蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数检出最高，因此选定pH 7。

图4 pH对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

2.3 蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果

综合单因素试验结果：温度、水浴时间和pH对蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖含量稳定性有影响，选取温度、pH、水浴时间3个因素进行响应面试验设计。采用Box-Behnken模型优化设计提取工艺条件，响应面试验设计方案及结果见表3，果糖和葡萄糖质量分数回归方程方差分析见表4，蔗糖质量分数回归方程方差分析见表5。

表3 Box-Behnken设计方案及试验结果

由表4可见：模型极显著（p＜0.01），说明该模型可以预测蜂蜜中果糖和葡萄糖质量分数最优稳定性条件。A、B、A2、B2、C2对果糖和葡萄糖质量分数影响显著（p＜0.05），C、AB、AC、BC 对果糖和葡萄糖质量分数的影响不显著；3个条件对果糖和葡萄糖质量分数稳定（C）C pH。

表4 果糖和葡萄糖质量分数的回归方程方差分析

由表5可见：模型极显著（p＜0.01），说明该模型可以预测蜂蜜中蔗糖质量分数最优稳定性条件；A、B、C、BC、A2、B2、C2对蔗糖质量分数影响显著（p＜0.05），AB、AC对蔗糖质量分数的影响不显著；3个条件对蔗糖质量分数稳定性影响大小顺序为（A）温度＞（B）水浴时间＞（C）pH。

2.3.2 各因素间的交互作用对果糖和葡萄糖、蔗糖质量分数的影响

等高线变化越密集，说明该因素对响应值影响越大。响应面曲线越陡，说明两者相互作用对响应值影响越显著，响应曲面越平滑，说明两者交互作用对响应值影响越不显著。根据图5~7等高线疏密程度可知，3种因素对果糖和葡萄糖影响大小顺序为（A）温度＞（B）水浴时间＞（C）pH，根据图8~图10，3种因素对蔗糖含量稳定性影响大小顺序为（A）温度＞（B）水浴时间＞（C）pH。再次验证了表4和表5的分析结果。

图10 水浴时间和pH交互作用对蔗糖质量分数影响的响应面和等高线图

表5 蔗糖质量分数的回归方程方差分析

图5 温度和水浴时间交互作用对果糖和葡萄糖质量分数影响的响应面和等高线图

图6 温度和pH交互作用对果糖和葡萄糖质量分数影响的响应面和等高线图

图7 水浴时间和pH交互作用对果糖和葡萄糖质量分数影响的响应面和等高线图

图8 温度和水浴时间交互作用对蔗糖质量分数影响的响应面和等高线图

图9 温度和pH交互作用对蔗糖质量分数影响的响应面和等高线图

2.3.3 响应面试验模型的验证

根据响应面模型得到蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数稳定性最优条件：温度69.7 ℃、水浴时间37.4 min、pH 7.05，果糖和葡萄糖质量分数理论值为66.474 1%，蔗糖质量分数理论值为1.850 96%。考虑到操作简便、实用，确定最优稳定性条件：温度70 ℃、水浴时间35 min、pH 7.0。在此条件下，进行3次验证试验，得出果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数与预测值接近。

2.4 储存时间对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖稳定性的影响

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖在0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8和9 d储存时间中质量分数分别见图11。

由图11可知，果糖、葡萄糖、蔗糖这3种糖质量分数在6 d之内相对比较稳定，随着储存时间延长，检出含量就越低。有可能是随着储存时间增加溶液里细菌等微生物滋生，降解蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖从而影响其稳定性，故在测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖含量时进行样品处理后只适合短期保存。

图11 不同储存时间下蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数的变化

3 结论与讨论

采用高效液相色谱法及蒸发光散射检测器通过温度、水浴时间、pH这3个因素试验表明对其稳定性都有影响。采用Box-Behnken响应面试验设计法研究蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数稳定性的结果表明，影响果糖和葡萄糖、蔗糖稳定性因素大小顺序为温度＞水浴时间＞pH。稳定性最优条件：温度70 ℃以下，水浴时间35 min以内，pH 7.0左右。

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖在处理样品后储存时间的稳定性试验结果表明，这3种糖质量分数随着储存时间延长，检出质量分数降低。试样处理完毕最适宜6 d之内果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数相对比较稳定。

果糖、葡萄糖、蔗糖是蜂蜜品质判断的重要指标，在试验过程中发现果糖、葡萄糖、蔗糖在高温、酸或碱性环境下质量分数会降低，有可能是因为温度较高破坏由于糖类和羟甲基糠醛的降解，产生一些酸性物质，如乙酰丙酸、甲酸、乳酸等物质导致蜂蜜中糖质量分数发生变化[21]。这样检测工作者在试验过程中遇到结晶的蜂蜜试样可用水浴待样品全部溶解后定容，但水温不宜过高；蜂蜜试样、糖类标准品尽量避免在酸性或碱性环境中储存，这就需要试验过程中避免盛放试样、标准品的容器残留酸、碱性试剂以免影响试验结果；蜂蜜试样随着储存时间越长也在不断地降低，有可能是随着储存时间加溶液里细菌等微生物滋生，降解果糖、葡萄糖、蔗糖。在测定蜂蜜试样处理样品后只适合短期保存，试样处理后可于6 d之内上机分析测试。若遇临界值附近样品有因未及时上机导致样品不合格需要重新配制标准品、样品复测。至于果糖、葡萄糖、蔗糖质量分数减少的真实原因需要科研工作者从微生物、分子结构或其他角度进行深层次研究，为日常检测工作提供理论依据。