动态高压下大豆分离蛋白/多糖复合物表征

敬思群，王德萍，周苗苗，纵伟

1.韶关学院英东食品学院（韶关 512005）；2.新疆大学生命科学与技术学院（乌鲁木齐 830046）；3.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，食品生产与安全河南省协同创新中心（郑州 450002）

大豆粕经过低温脱溶，得到一种新的蛋白类食品添加剂——大豆分离蛋白。大豆分离蛋白中蛋白质含量高达90%以上，富含人体所需的多种必须氨基酸，营养极其丰富[1-2]。大豆分离蛋白在起泡性、乳化性等功能特性方面特点突出，在食品加工生产中得到广泛应用，成为一种可以替代动物蛋白的优质植物蛋白[3-4]。但是单一的大豆分离蛋白在成膜的机械性能和功能特性方面存在着很大的不足，需要通过适宜的手段进行改性。多糖是由多个单糖分子经过缩合、失水等过程形成，相对分子质量大，分子结构复杂，多糖按极性可分为三大类，即阴离子多糖（壳聚糖）、阳离子多糖（卡拉胶）和中性多糖（葡聚糖）。多糖是高分子化合物，含有大量的极性基团，在疏水性、溶解性、黏度、稳定性等方面具有其独特的优势，在蛋白质改性方面和食品生产加工应用极其广泛。动态高压微射流技术（DHPM）是一种较为前沿的高压技术，结合高压理论、流体力学理论和撞击流理论，对流体物料进行强烈的剪切，瞬间压力，高速的撞击、高频的振荡等一系列联合作用，对待处理物料进行均一化、微乳化、超微化等操作[5-7]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大豆分离蛋白（纯度90%，食品级，哈高科大豆食品有限公司）；葡聚糖、卡拉胶、壳聚糖、三（羧甲基）氨基甲烷、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、叠氮化钠、十二烷基硫酸钠（均为分析级）。

FPG128000动态超高压微射流（英国SFP公司）；Nano-ZS90激光散射仪（英国Malern公司）；DYY-7C电泳仪电源（北京六一仪器厂）；JSM-6490LV扫描电镜（日本JEOL公司）；Vertex70傅里叶红外光谱仪（美国Bruker公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Chirascan圆二色光谱仪（英国应用光物理公司）；Vertex70傅里叶红外光谱仪（美国Bruker公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

称取适量大豆分离蛋白，加入去离子水，配制成质量浓度2.0 mg/mL的母液，用磁力搅拌器搅拌20 min使之充分溶解，使用胶体磨处理，将其细化及均匀分布，静置4 ℃环境下水化过夜，得到大豆分离蛋白水溶液。

分别称取适量的葡聚糖、壳聚糖和卡拉胶，加入去离子水，配制成质量浓度1.0 mg/mL的溶液，玻璃棒搅拌使其充分溶解，溶液中加入浓度0.02%的NaN3作为抑菌剂，防止细菌生长，静置4 ℃冰箱水化过夜，分别得到葡聚糖、壳聚糖和卡拉胶水溶液。

1.2.2 大豆分离蛋白-多糖动态超高压复合物的制备

将提前预处理好的大豆分离蛋白水溶液和多糖（分别为葡聚糖、壳聚糖和卡拉胶）水溶液按照2∶1比例进行混合，配置成大豆分离蛋白-多糖混合溶液。用玻璃棒搅拌使其混合均匀。采用PHB-3笔式pH计分别调节混合溶液的pH，大豆分离蛋白-葡聚糖混合溶液调至pH 7，大豆分离蛋白-壳聚糖混合溶液调节至pH 2，大豆分离蛋白-卡拉胶混合溶液调节至pH 10。采用动态高压微射流均质机对3种大豆分离蛋白-多糖混合溶液进行处理。均质压力120 MPa，循环处理2次（实验室前期研究所得），将处理液离心20 min，离心速度8 000 r/min，收集上清液，将其分成2个部分，一部分直接进行测定，另一部分样品冷冻干燥后进行后续测定。

1.2.3 SDS-PAGE分析

参考Mehrajfatema等[8]的方法进行SDS-PAGE试验操作。用考马斯亮蓝R-250试剂对凝胶胶片进行蛋白质染色[9]。

1.2.4 紫外分光光度计波长扫描

将大豆分离蛋白、多糖（葡聚糖、壳聚糖、卡拉胶）单物质和大豆分离蛋白-多糖超高压复合物分别配置成质量浓度0.1 mg/mL的溶液，用玻璃棒搅拌，使其充分溶解。采用紫外-可见分光光度计对待测样品进行波长扫描，波长扫描范围为190~500 nm，每个样品平行测定3次。

1.2.5 接枝度的测定

参照齐宝坤等的方法[10]，采用三硝基苯磺酸（TNBS）法测定大豆分离蛋白-多糖动态超高压复合物的接枝度。将处理好的待测样品于340 nm处测定其吸光度A。每个样品平行测定3次，取平均值进行计算。样品接枝度的大小反应大豆分离蛋白与多糖接枝聚合的程度，值越大，表明接枝聚合程度越大，反之则越小。接枝度的计算如式（1）。

式中：A样为大豆分离蛋白-多糖复合物吸光度；C样为复合物中大豆分离蛋白质量浓度，mg/mL；A白为大豆分离蛋白吸光度；C白为大豆分离蛋白质量浓度，mg/mL。

1.2.6 傅里叶红外光谱

参考Schestkowa等[11]的方法稍作改动。称取2 mg大豆分离蛋白-多糖动态超高压复合物粉末样品，加入适量干燥的KBr进行压片，将压片放入测定室内进行测定。扫描范围为4 000~400 cm-1，每个样品的红外图谱为扫面32次的叠加图。通过分析复合物红外吸收光谱变化，表征大豆分离蛋白与多糖的相互作用对蛋白质二级结构的影响。

1.2.7 内置荧光光谱

参考Morales等[12]的方法进行测定。用5 mmol/L磷酸标准缓冲液（pH 7）配制待测液（蛋白质量浓度1 mg/mL），在激发波长334 nm处用荧光分光光度计对样品进行发射波长扫描（350~500 nm），设置电压600 mV，激发和发射狭缝宽5 nm，记录各样品的荧光光谱。通过蛋白质溶液荧光强度的大小表征蛋白质与多糖结合程度，荧光强度越弱，大豆分离蛋白与多糖结合程度越大，反之则越小。

1.2.8 圆二色光谱

参考Zhang等[13]的方法进行测定。用0.01 mol/L磷酸盐标准缓冲液（pH 7）溶解一定量的待测样品（蛋白质量浓度0.1 mg/mL），设定扫描波长190~260 nm，样品池光程2 mm，分辨率0.5 nm，扫描速度100 nm/min，灵敏度100 mdeg/cm，试验在室温下进行。试验值为3次扫描的平均值。

1.2.9 统计分析

试验数据均采用SPSS 20.0软件进行处理和分析，采用Origin 8.0和Prism 6.0绘制图表，每次试验均进行3次平行，取平均值，试验结果以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与讨论

2.1 SDS-PAGE

采用聚丙烯酰胺电泳来分析大豆分离蛋白-多糖超高压复合物在形成过程中亚基的变化及相对分子质量的变化情况。图中1条带为大豆分离蛋白，2~4条带分别为葡聚糖、壳聚糖和卡拉胶，5~7条带为大豆分离蛋白-葡聚糖、大豆分离蛋白-壳聚糖和大豆蛋白-卡拉胶复合物。图谱结果表明，大豆分离蛋白条带是由β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各个亚基所组成。经过DHPM处理得到的大豆分离蛋白-多糖复合物在相对分子质量70~100 kDa的蛋白含量减少，在相对分子质量20~25 kDa出现新的条带，表明DHPM处理大豆分离蛋白和多糖，使得二者之间相互作用，形成复合物。

图1 大豆分离蛋白-多糖复合物SDS-PAGE图

2.2 全波长扫描光谱分析

多肽链中的一切原子单键的旋转产生空间排布的变化构成蛋白质的构象变化。蛋白质中氨基酸的微环境在一定程度上与光谱特征相关，因此用光谱特征的变化来反映蛋白质构象的变化情况。由图2可以看出，单纯的大豆分离蛋白在紫外光谱区域具有2个特征的蛋白质吸收带，其特征峰的大致位置分别在220 nm和280 nm附近。220 nm处的特征吸收峰主要是大豆分离蛋白肽键上的羰基的n-π*电子跃迁所引起；208 nm处的特征吸收峰是大豆分离蛋白分子中色氨酸和酪氨酸残基的芳香杂环π-π*和n-π*电子跃迁所引起。大豆分离蛋白220 nm处吸收峰强度远远大于280 nm处吸收峰强度。随着多糖加入，2个特征峰均呈现减弱趋势，表现为减色效应。220 nm处的吸收光谱减色效应更为明显，表明多糖的引入与蛋白质肽键上的羰基发生部分结合，使得复合物在220 nm处吸收峰强度减弱；同时，吸收峰的峰位发生蓝移（向短波长方向移动），也说明大豆分离蛋白分子的结构发生一定改变。

图2 大豆分离蛋白-多糖复合物紫外光谱图

2.3 接枝度（DG）的测定

糖基化反应是基于美拉德反应过程中发生的Amadori重排过程，使蛋白质分子中游离氨基基团连接到多糖分子的还原端。试验采用接枝度表征体系游离氨基的变化情况，从而表征大豆分离蛋白与多糖在动态高压微射流的作用下结合的情况。图3是大豆分离蛋白分别与葡聚糖、壳聚糖和卡拉胶经过超高压处理所形成复合物溶液的接枝度变化。3种复合物溶液接枝度与对照组相比较，显著性增加（p＜0.01）。这是由于动态高压微射流的处理产生热效应和空穴作用，蛋白质分子结构变得松散，溶解性增加，使得蛋白质可用自由氨基的数目显著增加，增加大豆分离蛋白与多糖分子的碰撞几率，提高大豆分离蛋白-多糖的接枝度，进而反映出大豆分离蛋白和多糖在超高压作用下结合的程度。

图3 大豆分离蛋白-多糖复合物接枝度的测定

2.4 大豆分离蛋白-多糖超高压复合物傅里叶红外光谱分析

大豆分离蛋白与多糖通过动态高压微射流处理形成复合物，使复合物的红外光谱与大豆分离蛋白单物质相比产生影响。如图4所示，大豆分离蛋白与多糖形成的复合物的特殊吸收峰的峰宽明显增大，主要是由于多糖与蛋白结合后其羟基含量增加。N—H伸缩振动峰位置发生不同方向偏移，这是由于大豆分离蛋白与多糖经过高压处理后，大豆分离蛋白中的氢键发生不同变化。酰胺I带在1 636 cm-1吸收峰变强，并且谱带的最高点发生迁移，酰胺基谱带向低波数迁移（蓝移）说明β-折叠增多。酰胺基谱带的变化说明不同多糖与大豆分离蛋白复合，对蛋白质二级结构的影响程度各不相同。

图4 大豆分离蛋白-多糖复合物红外光谱图

2.5 内置荧光光谱分析

由于蛋白质中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，这些基团是所有天然氨基酸中仅有的发荧光基团的氨基酸，是蛋白质内源荧光的主要来源。蛋白质溶液的荧光淬灭就是指溶液中淬灭分子与荧光物质分子之间发生相互作用，导致荧光物质的荧光量子效率降低或者激发态寿命缩短，进而导致溶液荧光强度降低。由图5可知，在存在多糖的条件下，通过动态超高压处理形成的复合物溶液中，荧光强度均明显减弱，这是由于淬灭体（多糖）和荧光发光体（SPI）之间通过超高压的作用相互碰撞，形成不发光的配合物，从而导致荧光物质荧光强度降低的过程。复合物溶液的最大发射波长发生位移变化，向低波长方向移动（蓝移），也证明大豆分离蛋白-多糖在超高压的作用下，环境的疏水性增强，蛋白质构象发生变化，形成的复合物趋向于折叠状态。

图5 大豆分离蛋白-多糖复合物内置荧光光谱图

2.6 圆二色光谱分析

蛋白质中生色基团主要是由肽链中的肽键、芳香氨基酸残基、二硫键等。圆二色谱的远紫外区段波长为190~250 nm，主要的生色团为肽键。参照待测蛋白质或者多肽的远紫外区圆二色谱图，可以推测待测蛋白质或者肽键相应的二级结构信息，进而揭示蛋白质或者肽键的二级结构。由图6可知，大豆分离蛋白在185 nm和208 nm处左右有2个负的肩峰，经过DHPM处理，形成的大豆分离蛋白-多糖复合物在208 nm处附近呈现出正峰，在222 nm处附近出现负峰。由表1可以看出，多糖与大豆分离蛋白通过超高压结合，导致β-折叠和无规卷曲均发生变化，SPI-G、SPI-CH和SPI-CA这3种复合物β-折叠和无规卷曲含量均增多（p＜0.05），二级结构发生改变。这可能归因于在动态超高压处理下，大豆分离蛋白由空化、剪切、高速撞击和高频振动引起大豆分离蛋白发生折叠，所以形成的复合物二级结构也发生变化。

表1 不同压力下大豆分离蛋白二级结构组分含量

图6 大豆分离蛋白-多糖复合物圆二色光谱图

3 结论

SDS-PAGE试验结果表明，DHPM处理大豆分离蛋白和多糖，出现新条带，使得大豆分离蛋白相对分子质量变小，形成相对分子质量较小的复合物。

结合紫外光谱、接枝度、傅里叶红外光谱、内置荧光光谱和圆二色光谱的分析结果可知，大豆分离蛋白与多糖（G、CH和CA）在动态超高压作用下形成的复合物，紫外光谱2个特征峰均呈现减弱趋势，表现为减色效应，吸收峰的峰位发生蓝移；与对照组（SPI）相比较，溶液接枝度显著增加；复合物红外光谱特殊吸收峰的峰宽明显增大，酰胺I带在1 636 cm-1吸收峰变强，并且谱带的最高点发生蓝移；荧光光谱显示复合物荧光强度均明显减弱，最大发射波长发生蓝移；圆二色光谱显示多糖与大豆分离蛋白通过超高压结合，导致β-折叠和无规卷曲均发生变化，二级结构发生改变。试验结果显示大豆分离蛋白与多糖在超高压作用下有效结合，形成复合物。