黑果腺肋花楸花青素的分离纯化

张卉，尤小明，刘姝含，臧淑艳

1.沈阳化工大学制药与生物工程学院（沈阳 110020）；2.湖北黄冈市中心医院（黄冈 438000）；3.沈阳化工大学理学院（沈阳 110020）

黑果腺肋花楸（Aronia prunifolia‘Viking’）属蔷薇科多年生落叶灌木，其果实中富含花青素。花青素不仅是一种天然可食用色素，而且具有抗肿瘤、抗氧化、预防糖尿病及高血压的作用[1-3]。由于花青素是从植物中提取，导致纯度低、杂质多，从而降低花青素的稳定性，影响其在原料药及功能性食品的开发应用[4]。因此，深入研究花青素的纯化工艺，对于花青素的进一步研发具有深远意义。

近年来大孔吸附树脂因具有吸附选择性好、富集效果强、可重复利用等优点，常被应用于花青素分离纯化研究[5]。王宏等[6]选用AB-8大孔树脂来纯化黑枸杞花青素，有效提高花青素纯度。王维茜等[7]将刺葡萄皮中粗提液依次经大孔树脂HP-20、聚酰胺树脂、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20吸附纯化，最终得到3种花色苷单体。张赛男等[8]使用HPD-100大孔树脂纯化玫瑰茄花色苷，将花青素的色价提高至38.5。国石磊等[9]采用大孔树脂纯化黑果腺肋花楸花青素，研究树脂与花青素的吸附-解吸条件。尚未见到国内外学者对于大孔树脂纯化黑果腺肋花楸花青素的吸附性能做深入探讨。因此，对纯化黑果腺肋花楸花青素大孔树脂的吸附型号、吸附条件及动力学深入研究，可为黑果腺肋花楸花青素的开发利用提供理论指导和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸（冷冻贮藏，辽宁华益农业有限公司）。

矢车菊素-3-O-半乳糖糖苷等标准品（上海哈灵生物技术有限公司）；HPD-450、X-5、AB-8、HPD-100型大孔吸附树脂（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙醇（天津市博迪化工股份有限公司）；盐酸、乙酸钠、氯化钾、氢氧化钠、柠檬酸（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；甲醇、乙酸、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

RE52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；T-5型紫外分光光度计（北京普吸通用仪器有限公司）；BT-100-1L型蠕动泵（Longerpump公司）；LYO GT2-2型真空冷冻干燥机（SPK公司）；HZP-150型全温振荡培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；Agilent1200液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；高效液相-质谱仪，由Agilent1290液相色谱。

1.3 试验方法

1.3.1 黑果腺肋花楸花青素提取液的制备

参考孙阳昭等[10]所用方法，提取溶剂改为酸化甲醇溶液（V甲醇∶V水∶V盐酸=80∶19∶1）。

1.3.2 花青素含量测定

以矢车菊素-3-O-半乳糖苷为标准品，pH示差法[11]测定样品中花青素含量。

1.3.3 大孔树脂的筛选

大孔树脂HPD-450、X-5、AB-8和HPD-100的处理方法参照文献[12-13]。

取经预处理的4种大孔吸附树脂各2.0 g，置于4个150 mL具塞锥形瓶中，每瓶加入50 mL花青素粗提液，在30 ℃、110 r/min条件下振荡24 h，过滤，测定滤液的花青素吸光度，按1.3.2方法计算滤液中的花青素，并按式（1）计算树脂的吸附率。将上述吸附饱和的4种树脂，分别加入50 mL pH 3.0、体积分数60%的乙醇溶液，同上述方法，按式（2）计算树脂解吸率。

式中：A为吸附率，%；C0为起始溶液花青素质量浓度，mg/g；Ce为吸附平衡溶液质量浓度，mg/g；D为解吸率，%；V1为吸附溶液体积，mL；V2为解吸溶液体积，mL；C1为解吸液花青素质量浓度，mg/g。

1.3.4 大孔树脂对花青素的静态吸附动力学研究

称取2.0 g经预处理的HPD-100大孔吸附树脂，置于150 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL花青素粗提液，在30 ℃、110 r/min条件下吸附一定时间：吸附0~15 min期间，每隔5 min测定样液吸光度；吸附15~105 min期间，每隔15 min测定吸光度；吸附105~195 min期间，每隔30 min测定吸光度；吸附195~325 min期间，每隔60 min测定吸光度，计算样液的花青素含量，按式（3）计算树脂的吸附量。分别采用准一级方程、准二级方程2个动力学模型[14]及颗粒内扩散模型[15]描述该树脂对黑果腺肋花楸花青素的吸附情况和扩散机理。

式中：W为大孔树脂吸附量，g；V1为吸附溶液体积，mL；C0为起始溶液花青素质量浓度，mg/g；Ce为吸附平衡溶液质量浓度，mg/g；Q1为花青素吸附量，mg/g。

1.3.5 大孔树脂静态吸附-解吸花青素试验

（1）温度对花青素吸附-解吸的影响

将50 mL pH 3.0的花青素溶液加入到预处理好的2.0 g大孔树脂中，分别在20，30，40，50和60 ℃，转数均为110 r/min条件下振荡4.5 h，按式（3）计算大孔树脂的吸附量。

（2）解吸液的体积分数对花青素解吸的影响

分别将50 mL体积分数30%，40%，50%，60%，70%和80%的酸性乙醇溶液，加入到吸附饱和的大孔树脂中，在30 ℃、110 r/min条件下振荡2.5 h，过滤，测定滤液中的花青素。

1.3.6 大孔树脂动态吸附-解吸花青素试验

将预处理过的12.5 g大孔树脂湿法装柱，以3 BV/h的速度将花青素粗提液上样，每0.5 BV收集一次流出液并测定其吸光度，绘制泄露曲线。将已吸附饱和的大孔树脂，用体积分数60%、pH 3.0的乙醇溶液以500 μL/min流速进行洗脱，每0.5 BV收集1次流出液，测定滤液中的花青素，绘制洗脱曲线。

1.4 HPLC-DAD分析

采用1200型号的液相色谱仪及二极管阵列检测器，分析得出黑果腺肋花楸花青素单体的种类和含量，色谱操作条件参考国石磊[16]，样品浓度2 mg/mL，柱温30 ℃，进样量25 μL，流速1 mL/min，检测波长520 nm。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

4种大孔树脂对黑果腺肋花楸花青素的吸附解吸附能力如表1所示。

表1 4种大孔树脂对花青素吸附与解吸性能

由表1可知，HPD-100型的大孔树脂对黑果腺肋花楸花青素吸附率达到90%以上，解吸率可达95%以上，选择其用于黑果腺肋花楸花青素的纯化。

2.2 HPD-100大孔树脂对黑果腺肋花楸花青素的吸附动力学研究

2.2.1 静态吸附曲线

HPD-100大孔树脂对黑果腺肋花楸花青素的静态吸附曲线如图1所示。

图1 HPD-100大孔树脂对花青素的静态吸附曲线

在吸附50 min内，HPD-100对花青素的吸附量增长迅速；50~175 min内吸附量增长速度逐渐降低；175 min后大孔树脂吸附量趋于平衡，平衡吸附量为2.73 mg/g。

2.2.2 HPD-100大孔树脂吸附花青素的动力学模型

HPD-100大孔树脂吸附花青素的动力学模型参数见表2。

由表2可知，HPD-100大孔树脂对黑果腺肋花楸花青素的吸附过程分别与准一级速率方程和准二级速率方程进行拟合，发现准二级速率方程的R2（0.991 8）大于准一级速率方程R2（0.939 8），说明该吸附过程属于单一化学吸附过程。

表2 HPD-100型大孔树脂吸附花青素动力学模型参数

2.2.3 HPD-100大孔树脂吸附花青素颗粒扩散模型

HPD-100大孔树脂吸附花青素粒子扩散模型参数见表3。

由表3可知，颗粒内扩散模型对整个吸附过程进行3个阶段的拟合，第1个阶段、第2个阶段和第3阶段分别属于薄膜扩散、粒子内部及平衡吸附阶段。通过对比3个阶段的速率常数Ki，薄膜扩散为主要控速步骤。

表3 HPD-100型大孔树脂吸附花青素粒子扩散模型参数

2.3 HPD-100大孔树脂对花青素静态吸附-解吸试验结果

2.3.1 温度对HPD-100大孔树脂吸附-解吸效果的影响

由图2可知，花青素吸附量随着温度升高逐渐下降，在50~60 ℃吸附量不再变化。原因在于在低温条件下花青素比较稳定，随着温度升高，花青素逐渐开始分解。

图2 温度对大孔树脂吸附花青素的影响

2.3.2 解吸液体积分数对HPD-100大孔树脂解吸花青素的影响

由图3可知，乙醇体积分数60%时，花青素洗脱效果最好。这是由于乙醇体积分数不同，乙醇溶液极性则不同，影响花青素和大孔树脂之间的分子作用力，从而影响解吸效果[17]。

图3 乙醇溶液体积分数对大孔树脂解吸能力的影响

2.4 动态吸附-解吸试验

由图4可知，随着上样量增大，流出液中花青素含量逐渐增加。流出液中花青素吸光度达到上样液花青素吸光值1/10时认为已出现泄露，即第8管（上样量达到4 BV）上样液时出现泄露。洗脱液用量至第21管时，洗脱液中花青素已完全洗脱。

图4 HPD-100大孔树脂对花青素吸附泄漏曲线及洗脱曲线

2.5 HPLC-DAD分析结果

黑果腺肋花楸花青素纯化样品在520 nm波长下的HPLC-DAD分析图谱如图5所示。

由图5可知，黑果腺肋花楸花青素可分离出4种单体成分，占比依次是49.04%，41.17%，3.34%及6.45%。经进一步研究发现组分1为矢车菊素-3-半乳糖苷，组分2为矢车菊素-3-阿拉伯糖苷，组分4为矢车菊素-3-木糖苷，组分3待进一步鉴定[18-20]。

图5 经HPD-100大孔树脂纯化后的花青素在520 nm下的HPLC图

3 结论与讨论

HPD-100大孔树脂对黑果腺肋花楸花青素有良好的吸附效果，30 ℃条件下4.5 h可完全吸附；该树脂对花青素的吸附过程符合准二级动力学模型描述，且以薄膜扩散为主；大孔树脂纯化花青素最佳条件为：花青素样液pH 3.0、上样量4 BV、上样流速700 μL/min、解吸液pH 3.0、解吸量5 BV、解吸流速500 μL/min。经大孔树脂纯化后的花青素在520 nm的条件下分离出4种黑果腺肋花楸花青素单体成分，即矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-木糖苷，还有一种待鉴定。

大孔树脂纯化花青素的机理是通过吸附和筛分2个机制共同作用实现。一方面，大孔树脂对花青素的吸附属于物理性吸附，吸附作用力为分子间引力，无需高活化能，吸附和解吸速度都较快。另一方面，树脂的多孔结构又使其对分子量大小不同的物质具有筛选作用。HPD-100大孔树脂为苯乙烯型非极性共聚体结构，适用于花青素这类弱极性的物质的纯化分离，与极性较大的大孔树脂相比，可在吸附花青素的同时，将一些水溶性多糖和氨基酸杂质滤去，且吸附过程不受无机盐存在的影响。因此，HPD-100大孔树脂在吸附纯化花青素的同时，可以去除花青素提取物中的糖、有机酸、矿物质及其他水溶性杂质，为花青素的开发利用打下基础。