基于芦笋榨汁残渣发酵生产超氧化物歧化酶酵素

苏政波，刘宝祥，傅茂润，马闯

1.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省食品发酵工业研究设计院山东省食品发酵工程重点实验室（济南 250013）；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院（济南 250353）

芦笋（Asparagus officinalisL），又名石刁柏、龙须菜，是一种多年生的健康蔬菜食品，被世界卫生组织列为世界十大最具有营养价值的蔬菜之首，具有营养高、能量摄入低的特点，是国际上公认的防癌保健蔬菜[1]。芦笋具有丰富的营养，可以被检出多糖、有机酸、氨基酸、甾体皂苷、黄酮、多肽及衍生物、多酚（羟基肉桂酸、黄酮、芪类、木酚素和去甲木脂素）等多种功能性物质，许多研究证明，芦笋具有降胆固醇、保肝、抗肿瘤、降血压、保肾、抗糖尿病、改善睡眠、抗焦虑等作用[2-3]。芦笋根中含有36.8%~52.89%糖类、17.93%粗纤维、2.95%~6.1%蛋白质、4.1%~8.83%皂苷、5%~6.2%油类、4.18%无机物，此外还有少量维生素C、黄酮和多酚。由于根部可以积累皂苷和果聚糖等，也常在中医中被用作辅助药物[4]。

超氧化物歧化酶（SOD）为广泛存在于生物机体内抗氧化酶的总称，能够清除动植物体内自由基和活性氧（ROS）[5]，普遍存在于酵母菌、动植物及所有真核细胞的生物中，在预防衰老和抗氧化等方面起到重要作用。SOD是抵抗ROS损伤的第一道防线，能够将超氧自由基转化为氧和过氧化氢，再由过氧化物酶分解为氧分子和水，从而避免机体的损伤[6-7]。根据其活性位点的金属离子可将SOD分为4类：铜锌-SOD、锰-SOD、铁-SOD和镍-SOD。Cu/Zn-SOD主要存在于真核细胞的细胞质、叶绿体和壁膜间隙中；Mn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中；Fe-SOD主要存在于原核生物、原生动物、少数几种藻类和植物中；Ni-SOD的研究较少，仅发现链霉菌属和蓝细菌中存在[6]。

已报道的研究主要通过收集葡萄酒或啤酒的废酵母，采用超声波破壁等方式破碎酵母细胞，以促进酵母胞内物质溶出，达到分离提取SOD的目的[8-12]。未提出成熟产业化生产方案，SOD的分离溶出所用试剂不能满足食用的要求，长期保存的方式等未见报道。芦笋残渣为制造芦笋浓缩汁过程中产生的废弃物，在压榨取汁后仍残余较多营养物质，如纤维素和蛋白质。近年来，国际上芦笋种植和加工发展迅速，国内用芦笋原料开发芦笋饮料，有关芦笋综合利用及提高原料利用率的研究也不断出现，芦笋废料的利用也越来越受到重视。

试验利用芦笋榨汁过程产生的废物残渣，提高芦笋利用率，所添加物质为食品级，可直接食用。芦笋残渣富含膳食纤维和其他营养物质，又可提供合成SOD所需的微量离子成分，通过添加酵母菌进行好氧发酵，代谢营养物质，同时在胞内累计SOD，通过破壁使胞内酶系溶出，以生产芦笋SOD酵素，为产品的进一步应用提供方法基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦笋（市售，产地为菏泽市）；纤维素酶、复合植物水解酶（诺维信生物技术有限公司）；纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶（青岛康地恩生物科技有限公司）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（南京建成科技有限公司）；白酒酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母（湖北安琪酵母有限公司）；麦芽提取物（上海金啤生物科技有限公司）；碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸等为分析纯；所用水为纯净水。

1.2 仪器与设备

HR1863榨汁机[飞利浦（中国）投资有限公司]；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；L550低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；VCX 600超声波反应器（Sonics &Materials，Inc.）；40-10S高压均质机（上海东华高压均质机厂）；722型可见分光光度计（上海菁华生化试剂仪器有限公司）；SPH-2101立式双层恒温摇床（上海世平实验设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 还原糖的测定

按照 GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》执行[13]。

1.3.2 蛋白质的测定

按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》执行[14]。

1.3.3 超声波破壁条件

发酵完成后，自然pH，冰水浴中在超声波功率300 W条件下超声波破壁处理15 min，按4 000 r/min离心10 min，收集上清液，待检。

1.3.4 超氧化物酶酶活力测定

芦笋酵素中SOD主要为Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，总超氧化物酶活力测定按照总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法）进行。总SOD活力（U/mL）按式（1）计算。

1.3.5 基本工艺

芦笋→清洗→榨汁→残渣→烘干→粉碎→过筛→复水→酶解→灭菌→接种→发酵→破壁→干燥→包装

2 结果与分析

2.1 原料制备

取适量新鲜芦笋，清洗后使用榨汁机榨汁，留取残渣置于50 ℃烘箱烘干至水分10%以下，使用粉碎机进行粉碎，取过0.075 0 mm（200目）孔径筛样品备用。取适量芦笋残渣，按照料水比1∶20（g/mL）定容，诺维信纤维素酶、复合植物水解酶和康地恩半纤维素酶各0.1%酶添加量，在自然pH条件下50 ℃酶解150 min；加入芦笋残渣质量0.1%木瓜蛋白酶，于50℃酶解120 min。经检测，总糖质量浓度为12.56 g/L，水溶性蛋白质量浓度为0.469 g/L。

2.2 发酵条件

2.2.1 料水比确定

取酶解好的物料，调整料水比至1∶20，1∶30和1∶40（g/mL），在121 ℃条件下灭菌20 min，接种葡萄酒酵母，在摇床28 ℃、200 r/min条件下发酵60 h。发酵完成后，超声波破壁，破壁率达到95%以上，检测SOD酶活力。

从图1可以看出，随着加水量加大，料水比1∶20和1∶30（g/mL）条件下SOD酶活力接近，料水比1∶40（g/mL）条件下SOD酶活力较低。料水比1∶20（g/mL）发酵后的物料性状达不到后续均质的要求，因此，选择1∶30（g/mL）作为发酵时的料水比。

图1 不同料水比发酵SOD酶活力

2.2.2 发酵过程SOD酶活力的变化

酶解后，调整料水比1∶30（g/mL），在121 ℃条件下灭菌20 min，接种葡萄酒酵母，在摇床28 ℃、200 r/min条件下发酵。分别取样，检测酵母菌数，超声波破壁后，检测SOD酶活力。

由图2可知，随着发酵进行，酵母细胞数和SOD酶活力逐渐上升，酵母细胞数在48 h达到最高，SOD酶活力在72 h达到最大。SOD为胞内酶，随着酵母菌的增殖，SOD酶活力逐渐升高，但并非与酵母细胞数增长完全对应。可能由于酵母菌的传代，SOD抵抗自由基的危害和菌体衰老，使得SOD酶活力上升[15]。

图2 发酵过程中SOD酶活力和细胞数的变化

2.2.3 营养源比较

酶解后，调整料水比至1∶30（g/mL），分别添加1%葡萄糖、1%麦芽提取物、1%葡萄糖和1%麦芽提取物，在121 ℃条件下灭菌20 min，接种葡萄酒酵母，在摇床28 ℃、200 r/min条件下发酵。分别取样，超声波破壁，检测SOD酶活力。

由图3可知，在酶解液中添加不同的营养源对SOD酶活力有较大的影响，相比不添加营养源（图1），同样发酵时间60 h，SOD酶活力分别提升17.42%，69.87%和21.15%。添加麦芽提取物对SOD酶活力提高效果最好，可能由于麦芽提取物中营养丰富，还原糖和游离氨基氮能够显著促进酵母菌的生长和增殖，从而促进SOD酶活力的提高。添加葡萄糖和麦芽提取物可能造成还原糖浓度较高，抑制菌体的生长和SOD的产生。添加麦芽提取物还可缩短发酵时间，显著缩短发酵周期，48 h时SOD酶活力达到最高。

图3 不同营养发酵过程中SOD酶活力的变化

2.2.4 不同酵母比较

酶解后，调整料水比至1∶30（g/mL），添加1%麦芽提取物，在121 ℃条件下灭菌20 min，分别接种白酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母，在摇床28 ℃、200 r/min条件下发酵。分别取样，超声波破壁，检测SOD酶活力。

通过比较3种不同菌种发酵过程中SOD的活性变化，葡萄酒酵母发酵产生SOD酶活力最高，啤酒酵母次之，白酒酵母最低。葡萄酒酵母更适宜试验的原料和发酵方式。

2.3 破壁条件的影响

超高压均质是一种具有广阔前景的非热加工技术，通过均质阀控制流体通过间隙的大小，产生高压、高速，达到高剪切、高速碰撞、空穴效应等作用[16]。同时，由于其可控制于低温运行，不会破坏食品的营养、风味和热敏物质，被广泛应用于破碎分散、减小颗粒粒径、代谢产物提取等生产。由于SOD为胞内酶，获得适宜的产品需先将其细胞壁破碎，才能使胞内物质溶出。试验以超声波破壁为参照，探索超高压均质技术对酵母菌进行细胞破壁的条件。

2.3.1 均质压力的影响

酶解后，调整料水比1∶30（g/mL），添加1%麦芽提取物，在121 ℃条件下灭菌20 min，接种葡萄酒酵母，在摇床28 ℃、200 r/min条件下发酵48 h以上，将发酵液降温至10 ℃以下，通入高压均质机于不同压力下进行破壁。

由图5可知，随着均质压力增大，SOD酶活力不断提高，说明随着均质压力增大，酵母菌能够逐渐破碎。均质压力达到80 MPa，SOD酶活力可以达到与超声波破壁类似的效果，与相关报道一致[17]。所以，酵母菌破壁所需均质压力选择80 MPa以上。

图4 不同酵母菌发酵过程中SOD酶活力的变化

图5 不同均质压力下SOD酶活力的变化

2.3.2 均质次数的影响

发酵48 h后，将发酵液降温至10 ℃以下，设置高压均质机压力80 MPa，通入发酵液，比较不同均质次数SOD酶活力的变化。

由图6可知，均质2次相比1次，SOD酶活力提高6.64%，说明均质2次能够达到更好的破壁效果，促进胞内物质的释放。均质3次相比2次SOD酶活力降低20.27%，均质次数过多或时间过长，高剪切和空穴效应可能造成一定SOD的失活。

图6 不同均质次数下的SOD酶活力

2.4 酵素功能活性评价

发酵48 h后，将发酵液降温至10 ℃以下，设置高压均质机压力80 MPa，通入发酵液，均质2次，将破壁发酵液速冻，进行冷冻干燥，经检测其SOD酶活力为403 U/g，酶活力基本无损失。

2.4.1 芦笋酵素在模拟胃液中的活性变化

经美国药典查询并改良：空腹时，胃液的pH 1.5；餐后胃液pH 3.0。配制模拟胃液：0.2% NaCl，加入950 mL蒸馏水，用盐酸分别调节pH为1.5和3.0，并定容到1 000 mL。模拟芦笋酵素在胃液高酸度条件下，SOD酶活力与时间的变化。

人体饮食先经过咀嚼再经食道到达胃内，温水溶解芦笋酵素可迅速到达胃中。胃液中pH较低，对食物活性影响较大。芦笋酵素在pH 3.0条件下，1 h内SOD酶活力保持86%，3 h内SOD酶活力保持约63.5%，较短时间可以保持芦笋酵素的活性。在pH 1.5条件下，SOD酶活力的损失相对比较大，1 h内SOD酶活力损失超过32%，3 h SOD酶活力损失超过50%。相比之下，芦笋酵素在餐后饮用为佳，能保持较好的活力。

2.4.2 溶解温度对芦笋酵素酶活性的影响

由于温度对各种酶的酶活力均有较大影响，温度过高可能使酶产生不可逆失活。针对冻干后样品，使用不同温度纯净水保温10 min，检测温度对SOD酶活力的影响。

由图8可知，不同溶解温度对SOD酶活力影响较大，50 ℃内酶活力损失在5%以内；溶解温度超过60℃，酶活力损失接近50%，损失较大。因此，应使用50 ℃以下常温水或牛奶溶解饮用。

图7 模拟胃液中SOD酶活力的变化

图8 不同溶解温度对SOD酶活力的影响

3 结论

通过对芦笋榨汁残渣的发酵、破壁和SOD活性研究，确定芦笋榨汁残渣发酵生产超氧化物歧化酶全营养酵素的工艺条件：调整料水比1∶30（g/mL），添加1%麦芽提取物，在121 ℃条件下灭菌20 min，降温后接种葡萄酒酵母，在28 ℃、200 r/min摇床发酵48 h；将发酵液降温至10 ℃以下，压力80~90 MPa均质2次，进行冷冻干燥，得到酵素成品。经检测，其SOD酶活力为403 U/g，呈黄色，具有芦笋的典型香气和酵母味，溶解后香气浓郁、无异味，溶解分散性较好。产品既含有芦笋中原有的膳食纤维、蛋白质，又经过酵母菌发酵和破壁，富含SOD、酵母胞内物质及代谢产物，经模拟胃液和温度条件的探索，建议餐后使用50 ℃以下常温水或牛奶溶解饮用。经过半年的常温阴凉处储存，芦笋酵素的活性保持较好，SOD酶活力的损失在10%以内，可常温长时间保存。