用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统研制及应用

孟永康，雷祝兵，梅 茜，董文飞

（1.长春理工大学 机电工程学院，吉林 长春 130022；2.中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所，江苏 苏州 215163；3.中国科学技术大学 生物医学工程学院（苏州）生命科学与医学部，安徽 合肥 230026）

1 引言

随着微流控技术的快速发展，微流控芯片可在几平方厘米甚至更小尺度上完成传统实验室的样品制备、分离、纯化、检测等过程[1]，具有体积小、集成度高、分析速度快、消耗试剂少等优点[2]，被广泛运用于生物医学、环境监测、分析化学等领域。其中碟式微流控芯片以离心力为液体流动的驱动力[3-4]，结合被动阀如毛细阀、虹吸阀[5-6]和主动阀如蜡阀[7]，只需要一个小型的电机就能同时对多个独立单元结构进行控制，实现对芯片内液体的精准控制[8]。此外，碟式芯片的多重分析单元可以同时检测多份样本，易于实现较高通量的检测[9]。目前，碟式微流控芯片已经广泛应用于血清分离、DNA提取、蛋白质和核酸分析等领域[10-11]。

尿液是易获得的体液来源，属于无创检测，传统的肾功能指标，如血尿肌酐水平检测[12]已经无法满足早期诊断的需要。尿液中蛋白质的含量高低是临床中对相关疾病进行诊断的一项重要指标[13]。例如视黄醇结合蛋白（RBP）主要在肝脏合成，分泌到血液的一种低分子量蛋白，分子量约为22 kD，可迅速被肾小球滤过，且绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，极少量从尿液排除。当肾脏滤过功能降低时，尿液中RBP含量显著升高。尿RBP排量与肾小管间质损害程度有明显相关性，可作为肾病监测、指导治疗和判断预后的指标[14-15]。大型、全自动生化分析系统在临床应用比较广泛，但目前针对尿液的蛋白质快速检测系统开发程度不足，检测特异性不高。

本文结合微流控技术与生化分析技术，设计了一款基于离心力驱动的碟式微流控芯片，实现微量样品转移、与试剂混合及检测等功能，使用COMSOL对芯片的毛细阀和虹吸阀结构进行仿真分析，验证结构的合理性，优化转速，采用高精度数控雕刻机制备芯片。围绕微流控芯片，研制了一套小型化、全自动尿液生化检测系统，并在该系统上进行了尿视黄醇结合蛋白检测分析，探讨了微流控芯片用于尿液蛋白自动化检测的可行性。

2 材料和方法

2.1 碟式微流控芯片设计和制作

微流控芯片制作所需的主要材料包括PMMA硬质塑料板材，PMMA薄膜，PMMA压敏胶，加工设备为数控雕刻机（北京精雕集团JDPMS6_A）。使用3D CAD软件（Solidworks 2016）绘制微流控芯片结构，如图1所示，芯片上含有4个相同的结构单元，每个单元由样品腔、试剂腔R1和R2、混合室、检测室、阀以及各腔室的通气孔组成。样品腔和检测室深度分别为0.5 mm和2 mm，试剂腔R1、R2和混合室深度为1.5 mm，虹吸阀和毛细阀的宽度和深度均为0.3 mm，而铁蜡阀的宽度和深度分别为1.1 mm和0.45 mm，详细尺寸如图2所示。将PMMA板材固定在机床台面上，根据宽度选择对应尺寸的刀具，腔室和铁蜡阀结构使用直径分别为1 mm和0.3 mm的单刃刀具，虹吸阀和毛细阀使用直径为0.2 mm的单刃刀具。将结构图转成数控代码导入数控雕刻机控制软件，通过雕刻机在PMMA板材加工出与绘制结构一致的微流道和腔室，如图3所示。芯片上多个单元既可以实现单人份不同物质的分析检测，也可以实现多人份同一物质的检测和多人份不同物质的检测。

图1 碟式微流控芯片示意图（a）和截面图（b）Fig.1 (a) Schematic diagram and (b) section view of a disc microfluidic chip

图2 微流控芯片单元结构和尺寸Fig.2 Unit structure and dimensions of a disc microfluidic chip

图3 芯片实物图Fig.3 Photograph of a disc microfluidic chip

为清除加工过程中在腔室和流道内及周边由飞屑导致的残留物，将芯片用含有Micro-90的去离子水超声清洗10 min，然后经过去离子水超声清洗 10 min，取出后用氮气吹干其表面，置于70℃烘箱烘干30 min。

2.2 铁蜡阀的设计和制备

采用数控精雕机在铝板上制作相同尺寸的铁蜡块模具，如图4(a)所示，模具孔洞尺寸为 1.1 mm×1 mm×0.5 mm。铁蜡溶液由融化的石蜡和铁磁液（Ferrotec MPG2100）[16]按体积比100∶1混合并搅拌均匀，将铁蜡溶液注入70℃铁蜡模具孔洞后自然冷却，脱模后取下铁蜡块（图4（b））备用。将铁蜡块填充到铁蜡阀腔室后，用PMMA压敏胶完成芯片粘合。铁蜡阀腔室的尺寸设计为1.1 mm×1.1 mm×0.45 mm，有利于铁蜡块填充，但铁蜡块与其腔室之间存在一定间隙，因此，将封装后的芯片在70℃的烘箱中放置2 min，此时，轻微融化的铁蜡将注满铁蜡阀腔室，从而确保铁蜡阀门呈关闭状态。需要开启时，使用456 nm、3 W激光二极管照射铁蜡块，铁磁液中纳米氧化铁颗粒吸收激光能量后升温至石蜡融化，流向两个辅助腔室的圆形区域，阀门开启的响应时间快至5 s，如图4（c）所示。

图4 铁蜡阀的制造和应用Fig.4 The fabrication and application of ferrowax valves

2.3 碟式微流控芯片被动阀结构仿真

碟式微流控芯片中的液体在离心力的作用下突破毛细阀进入下一个腔室的过程为不可压缩流体的液-气两相流，基本控制方程包括连续性方程、动量方程和计算相界面的水平集方程。

连续性方程为：

其中，u为流体速度，单位为m/s。

纳维-斯托克斯方程为：

其中，ρ为流体密度，单位为kg/m3；t为时间，单位为s；μ为流体动力黏度，单位为Pa·s；P为流体压力，单位为Pa；F为作用在流体上的体积力，单位为N/m3。

水平集方程为：

其中，

Φ为水平集函数，本文取为1；γ为初始化参数，单位为m/s；ε为界面厚度控制参数，单位为m；ρ1和ρ2分别为连续相、离散相的密度，单位为kg/m3；μ1和μ2分别为连续相和离散相的动力黏度，单位为Pa·s。

采用COMSOL Multiphysics软件对试剂腔R1（水，深红色）和混合室1（空气，蓝色）建立流体力学模型进行仿真[17]。室温25℃时，水和空气的密度分别为977 kg/m3和1.614 kg/m3，动力黏度分别为8.55×10−4Pa·s和1.864×10−5Pa·s，水-空气表面张力为7.2×10−2N/m。对物理场各参数进行初始设置，由于液体较少，可以忽略重力对液体的影响。入口为R1腔室的进样口，设置速度为零；出口为混合室底部，液体突破毛细阀进入混合室与静压力无关，所以设定出口压力为零。指定无滑移壁面边界条件（即速度为零），除入口和出口外的所有边界为湿壁。以芯片圆心为旋转中心，试剂腔R1距离圆心9 mm，试剂腔R1为水相，扩散 系 数 为1×10−9m2/s，其 余 壁 面 的 接 触 角为72°（芯片材料为PMMA），通过旋转芯片产生离心力和科里奥利力控制流体流动，而这些力可通过改变角速度来调节，使用水平集的方法计算液面变化。通过仿真计算显示角速度达到60 rad/s（约为9.55 r/s）时，液体突破毛细阀进入混合室。图5（彩图见期刊电子版）仿真结果用流体（水）的体积分数来表达，即采用体积分数表示流体（水）在芯片中的流动，通过不同相函数Φ的变化，追踪不同相边界的变化。如图5所示，标尺液体首先在与混合室的连接处形成一个圆弧型的弯月面，在离心力作用下，液体陆续进入混合室。

图5 液体突破毛细阀仿真图Fig.5 Simulation results of liquid breaking through the capillary valve

采用同样方法对样品室（水）和虹吸阀（空气）建立流体力学模型，并进行模拟仿真。初始界面为样品室和虹吸阀的连接面，当角速度为60 rad/s时，液体不能突破虹吸阀；角速度降低为6 rad/s(约0.95 r/s)时，样品室液体在1 s时即可突破虹吸阀顶部，仿真结果如图6所示。在高速旋转时，离心力将液体保持在虹吸管道顶端下方，液体不能转移到混合室，当转速降到低于临界值，毛细力引发虹吸作用，液面超过虹吸管道顶部开始流动。

图6 不同转速的虹吸阀仿真结果Fig.6 Simulation results of siphon valve at various spin speeds

2.4 模拟实验过程

为了验证芯片内液体的流动情况，采用混入红、绿色素的纯水代替样品和试剂进行实验，通过高帧频相机记录液体在芯片内转移的过程，如图7（彩图见期刊电子版）所示。

图7 样品和试剂的转移和混匀Fig.7 The transport and mixing of the sample (light pink)and reagent (green and red)

将淡粉色水、绿色水和红色水分别加入样品室、试剂腔R1和试剂腔R2，在转速为10 r/s时，R1腔室中绿色液体先进入混合室1，降低转速到1 r/s，样品室中的淡粉色液体填充虹吸阀，再次提高转速至 20 r/s，红色液体从样品室和虹吸阀中转移到混合室1中。在转速为5 r/s时正转45°，反转45°，持续10 s使液体混合，混合结束后，降低转速至0.9 r/s，使混合室中的液体填充虹吸阀，提高转速至10 r/s，转移液体到检测室。采用465 nm激光照射使铁蜡阀中铁蜡溶解，并打开阀门，接着提高转速至10 r/s，将红色液体从R2腔室转移到检测室，调节电机转速为5 r/s，正反转45°持续10 s对试剂进行混合。

3 检测原理和双光路补偿

3.1 光学检测原理

微流控生化分析系统的检测原理是基于光电比色法和郎伯比尔定律（Lamber-Beer law），其表达式为[18]

其中，A为吸光度；I0为入射光强；I为透射光强；k为吸光系数，单位为L/g·cm；b为光程，单位为cm；c为被测物的质量浓度，单位为g/L。

3.2 检测系统控制结构

检测系统由上位机、单片机、旋转电机、LED光源和信号采集系统等组成，如图8所示，上位机通过串口通信向单片机发送控制指令，调节电机的速度参数（加速度和终速度）、启动及停止电机，实现对芯片的转动控制。样品和试剂在离心力及毛细力作用下转移、混匀，最后在检测室发生反应并进行吸光度检测。检测时LED光源非持续性发光，采用旋转检测方式，芯片上4个单元逆时针依次经过检测位置，单片机控制光源开启，光源通过光纤传输到芯片检测室上方，透射过芯片的光源再次通过光纤传输到光电二极管，经信号放大模块放大后，通过USB-4704数据采集卡（研华科技）转化成数字信号，采样频率为20 Hz，最后传输到上位机并进行存储。

图8 系统控制流程图Fig.8 Flow chart of the system control

3.3 光源波动的双光路补偿

检测系统采用测量光和参考光双光路补偿设计，可消除光源自身波动引起的误差，其实物图如图9（a）所示。微流控芯片的光学检测装置包括光源、聚光透镜、滤光片、二向色镜、非偏振分束立方体、带准直透镜的光纤、光电二极管等，如图9（b）（彩图见期刊电子版）所示，红色箭头代表700 nm光源光路，绿色箭头代表546 nm光源光路。光源经过滤光片和聚光透镜后，通过非偏振分束立方体中的10∶90分束镜，即一束10%的光直接进入参考光路的光电二极管；另一束90%的光经过聚光透镜和光纤接头，再从光纤末端的自聚焦准直透镜进入芯片检测腔室，透射出的光再次通过光纤传送到光电二极管转化为电信号。

图9 光学检测系统Fig.9 Optical detection system

光源发出的光强设置为I0，非偏振分束立方体的分光比为RR/RS，测量光路受到光纤的影响为αS，两个光路使用相同的放大模块对光电二极管产生的信号进行处理，假定测量通道放大模块对光强的影响为βS，参考通道放大模块对光强的影响为βR。

下位机测量通道采集的电压信号为

参考通道采集的电压信号为

由于使用的放大模块相同，所以βS和βR的值相等，将式（7）和式（8）相除得

在测量通道的光纤没有受到外界影响的情况下，光纤对测量通道的影响保持不变，所以αS为固定值，非偏振分束立方体的分光比为固定值，因此M为常数。

对光源变化导致的参考光路和检测光路电压改变进行测量，通过对测量数据进行线性拟合，用于检测系统的补偿修正。对波长为546 nm和700 nm的光源分别进行3次测量，并通过Matlab对两个光路采集的数据进行拟合，以参考通道数据为x轴，测量通道数据为y轴，两个通道在不同波长的光源下拟合关系如图10所示。结果表明两个通道都具有较好的线性相关性（即拟合优度R2接近1），且具有较好的重复性。546 nm波长下，两光路的线性关系近似为y=3.3x+0.08；700 nm波长时，两光路的线性关系近似为y=2.54x+0.08。拟合得到的线性关系系数将用于后续生化检测实验的两个光路补偿修正。

图10 双光路线性关系Fig.10 The linear relationship between two optical paths

4 实验和结果

4.1 试剂和方法

尿视黄醇结合蛋白（Urinary Retinol Binding Protein, URBP）检测试剂盒，包括URBP低浓度（1 mg/L）和高浓度（4.3 mg/L）质控品、URBP校准品（9.3 mg/L）、缓冲液（R1）和包被抗体的乳胶微球（R2），购自宁波美康生物科技股份有限公司。

检测原理为乳胶增强免疫比浊法，其主/副波长为546 nm/700 nm，分析方法为两点终点法。

检测步骤如下：将5 μL样品，120 μL R1和30 μL R2分别加入芯片的样品室，试剂腔R1和试剂腔R2，将芯片放入检测系统，启动控制程序。简言之，R1和样品先后进入混合室，混匀后孵育5 min，然后转移到检测室。在铁蜡阀开启后，R2进入检测室混匀，孵育10 s后，读取546 nm和700 nm的吸光度值，计算第一点吸光度值，即A1=A546−A700；孵育5 min后再次读取546 nm和700 nm的吸光度值，计算第二点吸光度，；计算两点吸光度差值，即ΔA=A2−A1。

4.2 芯片检测URBP精密度

根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）EP05-A3指南对精密度的验证方法，分别测试高低两个临床诊断水平的URBP浓度（1 mg/L和4.3 mg/L），上述两个浓度的质控品均来自宁波美康生物科技股份有限公司，已获得医疗器械注册证（浙械标准20142400062），将高低浓度的质控品在芯片上各重复测试10次，分别计算平均值、标准差和变异系数(CV)。表1为低浓度质控品（1 mg/L）重复测量的两点吸光度差值，经计算ΔA的平均值为0.00999，标准差为0.00024，CV为2.42%；表2为高浓度质控品（4.3 mg/L）重复测量的两点吸光度差值，计算ΔA的平均值为0.03853，标准差为0.0005，CV为1.30%。高浓度和低浓度质控品精密度都满足CV≤5%，说明系统具有较好的重复性。

表1 芯片检测1 mg/L URBP质控品的吸光度差值Tab.1 Absorbance difference of 1 mg/L URBP quality control product measured by the microfluidic chip

表2 芯片检测4.3 mg/L URBP质控品的吸光度差值Tab.2 Absorbance difference of 4.3 mg/L URBP quality control product measured by the microfluidic chip

4.3 校准曲线

将浓度为9.3 mg/L URBP校准品用生理盐水按稀释因子1、1/2、1/4、1/8、1/16和0稀释为6个浓度梯度9.3 mg/L、4.65 mg/L、2.32 mg/L、1.16 mg/L、0.58 mg/L和0，每个浓度重复测定3次。以校准品浓度为横坐标，各浓度校准品对应的吸光度差值的平均值为纵坐标，进行logit曲线拟合，得到曲线如图11所示。

图11 校准曲线Fig.11 Calibration curve

线性拟合得到的浓度和吸光度差值的线性关系为y=A2+(A1−A2)/[1+(x/x0)p]，其中A1=0.00314，A2=0.05668，x0=3.28686，p=1.60767，拟合系数R2=0.99549，结果表明浓度和吸光度值有良好的相关性。

5 结论

本文构建了一款基于离心力的集成碟式微流控芯片，阐述了芯片的结构和制造工艺，并研制了全自动尿液蛋白质检测系统，通过双光路设计和双波长检测方法降低光源波动和背景干扰对检测结果的影响。整个过程只需加样、离心、孵育和光电检测等过程全部在芯片上完成，10 min左右可完成4个样本的测试，设备具有便携、操作简单、样品用量少、检测效率高等优点，可广泛用于各类现场检测。

采用尿RBP质控品和校准品作为实验样本，分别验证了系统的精确度和校准曲线。实验结果显示，两个浓度质控品精密度的变异系数在1.3%～2.46%，说明系统具有较好的重复性。尿RBP校准品的浓度梯度实验表明浓度和吸光度值有良好的线性相关性（R2=0.995）。上述结果证明了芯片及尿液蛋白检测系统的可行性以及实用性，该芯片的临床有效应用还需要大量实验的进一步验证，但本系统为后续基于离心力的微流控芯片的化学发光免疫分析、核酸检测等奠定了研究基础。