复方抗病毒口服液的提取工艺优化

吴保庆，张巧梅，黄兰秀，陈振威，曹远东，周 志

(1.海大畜牧水产研究中心，广东广州511490；2.广州和生堂动物药业有限公司，广东广州510550；3.江西嘉博生物工程有限公司，江西九江332600)

近年来，随着抗生素禁令的逐步实施，人们对兽用抗生素滥用的危害也愈加警觉，在此背景下，中兽药制剂逐渐成为研究热点。复方抗病毒口服液，由连翘、金银花、黄芩、栀子、桔梗、甘草六味中药制成。六味药根据中医中药的遣药组方原则，按照君、臣、佐、使进行配伍，具有清热解毒的功效，主治外感发热，在临床上可用于畜禽多种病毒病的防治。胡克杰等[1]通过实验表明，连翘脂苷对合胞病毒有抑制作用，有效抑制浓度为0.39 mg/mL。段林建等[2]研究表明，连翘苷抗病毒作用是通过抑制甲型流感病毒核蛋白转染后的表达来实现的。Li等[3]研究表明连翘酯苷A对鸡传染性支气管炎病毒具有体外抑制作用。马元元等[4]研究表明，连翘苷对圆环病毒的抑制呈浓度依赖性。金银花与连翘同为君药，其中的有机酸对病毒具有一定的抑制作用[5-7]。

研究采用正交法优化复方抗病毒口服液的提取工艺，通过HPLC法测定复方抗病毒口服液中连翘苷和绿原酸的含量，优选出复方抗病毒口服液的最佳提取工艺，为临床生产提供一定的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent-1260 II高效液相色谱仪、AL-204电子天平、0.22 μm滤器。

1.2 材料 连翘300 g、金银花150 g、黄芩150 g、栀子100 g、桔梗50 g、甘草50 g，购自河北全泰药业有限公司(批号：20200513)。

连翘苷(批号：110821-201112)，购自中国食品药品检定研究院，绿原酸(批号：110753-202018)，购自中国食品药品检定研究院。

2 方 法

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间的考察 称取药材5份粉碎，加入10倍量的水量浸泡1 h，提取温度控制在80 ℃，提取2次，每次提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h，合并两次滤液，放置在60 ℃减压干燥箱中浓缩成相对密度为1.05的浸膏，以连翘苷、绿原酸含量和干膏得率为考察指标，考察提取时间对提取工艺的影响。

2.1.2 提取次数的考察 称取药材5份粉碎，加入10倍的水量浸泡1 h，提取温度控制在80 ℃，每次提取1 h，提取次数为1、2、3、4、5次，合并滤液，放置在60 ℃减压干燥箱中浓缩成相对密度为1.05的浸膏，以连翘苷、绿原酸含量和干膏得率为考察指标，考察提取次数对提取工艺的影响。

2.1.3 料液比的考察 称取药材5份粉碎，分别加入5倍、8倍、10倍、15倍、20倍水量浸泡1 h，提取温度控制在80 ℃，提取2次，每次1 h，合并滤液，放置在60 ℃减压干燥箱中浓缩成相对密度为1.05的浸膏，以连翘苷、绿原酸含量和干膏得率为考察指标，考察加水量对提取工艺的影响。

2.2 正交试验设计 根据单因素试验结果，选取提取时间、提取次数、料液比三个因素，进行三因素三水平L9(33)的正交试验，试验设计表见表1。

表1 L9(33)正交试验设计表

为了更加准确地评估药效，采用加权评分法将各主要因素综合评分。根据主次关系，人为的将连翘苷含量权重系数设置为0.4，绿原酸含量权重系数设置为0.4，干膏得率权重系数设置为0.2。

综合评分 = (连翘苷含量 / 最大连翘苷含量)×100×0.4 +(绿原酸含量 / 最大绿原酸含量)×100×0.4 +(干膏得率 / 最大干膏得率)×100×0.2。

2.3 含量检测

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Wonda SiLTMC18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为25 ℃。连翘苷含量检测：以乙腈-水(25∶75)为流动相，检测波长为278 nm；绿原酸含量检测：以甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)为流动相，检测波长为324 nm。

2.3.2 溶液的制备

2.3.2.1 对照品溶液 精密称定连翘苷对照品适量，加50%甲醇制成60 μg/mL的连翘苷对照品溶液；精密称定绿原酸对照品适量，加水制成40 μg/mL的绿原酸对照品溶液。

2.3.2.2 供试品溶液 精密量取本品1 mL，加在中性氧化铝柱上，用70%乙醇40 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加50%甲醇适量，温热使溶解，转移至100 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得连翘供试品；精密量取本品2 mL，置100 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得金银花供试品。

2.3.3 标准曲线 将配制的连翘苷对照品溶液，用50%甲醇依次稀释成10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL的标准溶液；将配制的绿原酸对照品溶液，用水依次稀释成20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的标准溶液，按照上述色谱条件进行检测，以标准液浓度为横坐标，以吸收峰面积为纵坐标，建立标准曲线，得线性回归方程和相关系数。

2.4 统计分析 运用SPSS17.0软件对数据进行正交统计分析。

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 提取时间的考察 由表2可见，随着提取时间的增加，连翘苷含量、绿原酸含量和干膏得率先增加后降低，所以确定正交试验的提取时间为1、1.5、2 h。

表2 提取时间的考察

3.1.2 提取次数的考察 由表3可见，随着提取时间的增加，连翘苷的含量、绿原酸的含量先增加后降低，干膏得率先升高后趋于平稳，综合分析，确定正交试验的提取次数为2次、3次、4次。

表3 提取次数的考察

3.1.3 料液比的考察 由表4可见，连翘苷含量、绿原酸含量和干膏得率在料液比为1∶8、1∶10、1∶15时都比较高，确定正交试验的料液比为1∶8、1∶10、1∶15。

表4 料液比的考察

3.2 正交试验 由表5可见，三种因素对提取工艺的影响顺序为B(提取次数)>C(料液比)>A(提取时间)，表6方差分析看出，三个因素均无显著性差异，综合方差分析与极差分析，确定最佳工艺为A1B1C1，即提取时间为1 h，提取次数为2次，料液比为1∶8。

表5 正交试验结果

表6 方差分析

3.3 标准曲线 由表7可见，以对照品浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标建立的标准曲线，线性回归方程、相关系数和线性范围。

表7 对照品的线性方程、相关系数、线性范围

4 讨论与结论

连翘、金银花为君药，连翘的主要生物活性成分有连翘苷、连翘酯苷、挥发油等，连翘善走上焦以泻心火，破血结，消痈肿。金银花，既能清气分之热，又能解血分之毒，两药合用，并走于上，升浮宣散，清气凉血、清热解毒，可用于外感风热，疮痈肿毒，咽喉肿痛。通过单因素试验将对提取工艺有影响的因素进行考察，由于连翘苷与绿原酸对温度都比较敏感，温度过高会破坏连翘苷的结构，使其变性[8]，升温可以破坏金银花的成分，使绿原酸更好的溶出，绿原酸本身不稳定，过高的温度，会使其内部基团发生反应，绿原酸浓度下降[9]，故将提取温度固定在80 ℃。对提取时间的考察，结果显示随着提取时间的增加连翘苷含量、绿原酸含量均为先升高后降低，这可能是由于随着提取时间的增加，有效成分逐渐溶出，当有效成分基本溶出完全时，提取时间的增加会导致有效成分的降解。对提取次数的考察，随着提取次数的增加连翘苷含量、绿原酸含量先增加后降低，可能是由于前几次的提取已经将有效成分提出，过多的提取不会再有有效成分的溶出[10]。对料液比的考察，随着料液比的增加，会增大药物与溶剂的接触面积，利于有效成分的溶出[11]，但是过大的料液比会增加能源成本。根据单因素试验的结果设计正交试验，以连翘苷含量、绿原酸含量和干膏得率为考察指标，采用加权法对各因素进行综合评分，使结果更加客观、准确。

研究表明，复方抗病毒口服液提取温度控制在80 ℃，提取时间为1 h，提取次数为2次，料液比为1∶8时，综合评分最高，作为优选提取工艺。