lncRNA CASC7 靶向下调miR-181a-2-3p 表达影响非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭①

2021-11-25陈永倖海南省人民医院呼吸与危重症医学科海口570100

中国免疫学杂志 2021年19期

蒙冲谢甜陈永倖（海南省人民医院呼吸与危重症医学科，海口570100）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常见的类型之一，占肺癌患者80%以上［1］。NSCLC 早期诊断率低，多数患者确诊时已处于中晚期，预后不佳［2］。长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）是两类与人类多种疾病尤其是肿瘤的发生发展密切相关的小分子非编码RNA，且两者可相互作用［3-5］。癌易感性候选基因7（CASC7）长度为9.3 kb，属于lncRNA。研究显示，CASC7 在直肠癌组织和细胞系中表达降低，其过表达通过靶向抑制miR-21 降低结肠癌细胞的增殖和迁移［6］。但目前，CASC7 对 NSCLC 发生发展的影响机制还未知。DIANA-LncBase v2 在线预测软件显示，CASC7与miR-181a-2-3p的核苷酸序列存在连续结合位点，提示两者之间可能存在相互作用。研究显示，miR-181a-2-3p 在甲状腺乳头状癌中表达上调，参与该疾病的发生发展［7］。但目前，miR-181a-2-3p 在NSCLC 组织中的表达及其对NSCLC 细胞恶性生物学行为的影响也还未知。本研究首先检测了39 例NSCLC 患者组织和对应的癌旁组织中CASC7与 miR-181a-2-3p 的表达，并以 NSCLC 细胞 A549 为研究对象，观察了CASC7 对A549 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其能否靶向调控miR-181a-2-3p发挥作用，以期为NSCLC 的分子治疗提供可能的靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料收集2017 年10 月至2018 年12 月于本院行手术切除的39 例NSCLC 患者的癌组织和对应的癌旁组织，并在液氮中保存。其中39例患者中男性患者23 例，女性患者16 例，平均年龄（64.29±8.76）岁。TNM 分期Ⅰ期 6 例，Ⅱ期 12 例，Ⅲ期21例；淋巴结发生转移24例，未转移15例。纳入标准：经病理诊断确诊；手术前未进行放疗、化疗等治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；合并肝、肾等重要脏器功能障碍者；合并自身免疫系统疾病患者。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者知情同意。

1.1.2 实验细胞和试剂 NSCLC 细胞A549 购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清（FBS）购自美国Hycolne 公司；RPMI1640 培养基、四甲基噻唑蓝（MTT）、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000试剂盒、双荧光素酶活性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒和PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Trizol试剂购自美国 Invitrogen 公司；PCR 引物、CASC7 过表达载体（pcDNA-CASC7）、miR-181a-2-3p 模拟物（mimics）和抑制剂（anti-miR-181a-2-3p）及各自的对照序列pcDNA、miR-NC 和 anti-miR-NC 均购自广州锐博生物科技有限公司；细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）、基质金属蛋白酶 2（MMP-2）、MMP-9 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测CASC7和 miR-181a-2-3p 的 mRNA 表达 Trizol 试剂提取组织中总RNA，反转录为cDNA，行PCR 扩增。扩增条件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 个循环。引物序列见表1。CASC7 以GAPDH 为内参，miR-181a-2-3p 以 U6 为内参，2-ΔΔCt法计算CASC7和miR-181a-2-3p水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 细胞培养和转染复苏A549 细胞，加含10% FBS 的RPMI1640 培养基培养。以1×105个/孔将A549 细胞接种于6 孔板，采用LipofectamineTM2000 脂质体法，分别转染 pcDNA-CASC7（pcDNACASC7 组）、pcDNA（pcDNA 组）、pcDNA-CASC7 与anti-miR-NC（pcDNA-CASC7 与 anti-miR-NC 组）、pc-DNA-CASC7 与 anti-miR-181a-2-3p（pcDNA-CASC7+anti-miR-181a-2-3p 组）。转染 6 h 后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞备用。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 PCR 扩增含miR-181a-2-3p结合位点的CASC7的3'UTR 序列，分别构建CASC7野生型质粒（CASC7-WT）和突变型质粒（CASC7-MUT）。将 CASC7-WT、CASC7-MUT 与miR-181a-2-3p mimic、miR-NC 共转染至 A549 细胞。转染6 h 后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞检测荧光素酶活性。

1.2.4 MTT 实验以0.5×104个/孔将各组细胞接种于96 孔板，并以未转染的A549 细胞作为对照组，每组设3个复孔。培养24 h，加20 μl的MTT（5 g/L）。然后孵育4 h，弃培养基，加150 μl 二甲基亚砜。振荡混匀，于MB-530型多功能酶标仪490 nm处测光密度（OD）值。实验重复3次。

1.2.5 Transwell 实验调整各组细胞密度为5×104个/ml。迁移实验：Transwell 上室加 100 μl 细胞悬液，下室加500 μl 培养基。培养24 h，弃培养基，经4%多聚甲醛固定、0.4%结晶紫染色后，显微镜观察并拍照，对穿膜细胞进行计数。侵袭实验：Matrigel 基质胶4℃ 融化，铺于Transwell 上室，自然晾干后再加100 μl 细胞悬液，后续实验步骤同迁移实验。

1.2.6 细胞凋亡检测实验以1×104个/孔将各组细胞接种于24 孔板。培养24 h，收集细胞。参照Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明书，采用CytoFLEX型流式细胞仪检测细胞凋亡。凋亡率（%）=（早期凋亡数+晚期凋亡数）/细胞总数×100%。

1.2.7 Western blot 实验以1×104个/孔将各组细胞接种于24 孔板。培养24 h，收集细胞。RIPA 试剂提取总蛋白，BCA 法对蛋白定量。然后进行10%SDS-PAGE 电泳。电泳后，湿转至PVDF 膜。接着置于5%脱脂奶粉中封闭1 h，再分别加入CyclinD1（1∶1 000）、cleaved-caspase-3（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 500）和MMP-9（1∶1 500）一抗，4℃ 孵育过夜。加山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。加化学发光试剂，避光显影，CSL-MDOCUV 1D 型凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析 SPSS22.0 软件分析实验数据。符合正态分布的计量资料以表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。Pearson 相关性分析NSCLC 患者癌组织中CASC7 和miR-181a-2-3p 表达的相关性。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CASC7 和 miR-181a-2-3p 在 NSCLC 患者癌组织中的表达与癌旁组织比较，NSCLC 患者癌组织中 CASC7 表达水平降低（P＜0.05），miR-181a-2-3p水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 CASC7 和miR-181a-2-3p 在NSCLC 患者癌组织中的表达水平（，n=39）Tab.2 Expression levels of CASC7 and miR-181a-2-3p in cancer tissues of NSCLC patients（，n=39）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

miR-181a-2-3p 1.04±0.08 2.59±0.111）71.167＜0.001 Groups Adjacent tissues Cancer tissues t P CASC7 1.01±0.09 0.31±0.061）40.415＜0.001

2.2 NSCLC患者癌组织中CASC7和miR-181a-2-3p表达的相关性 Pearson 相关性分析结果显示，NSCLC 患者癌组织中 CASC7 与 miR-181a-2-3p 的表达呈负相关（r=-0.694，P＜0.001）。见图1。

图1 NSCLC 患者癌组织中CASC7 与miR-181a-2-3p 表达的相关性Fig.1 Correlation between CASC7 and miR-181a-2-3p expression in cancer tissues of NSCLC patients

2.3 CASC7 靶向负调控 miR-181a-2-3p CASC7 与miR-181a-2-3p 的核苷酸的结合位点见图2。miR-181a-2-3p 可降低 CASC7-WT 的荧光素酶活性（P＜0.05），而对CASC7-MUT 的荧光素酶无显著影响（P＞0.05），表明 CASC7 可与 miR-181a-2-3p 靶向结合，见表 3。与 pcDNA 组比较，pcDNA-CASC7 组细胞中CASC7表达水平升高，miR-181a-2-3p表达水平降低，进一步说明CASC7 负调控miR-181a-2-3p，见表4。

表3 双荧光素酶报告基因实验结果（，n=9）Tab.3 Experimental results of dual luciferase reporter genes（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

CASC7-MUT 1.02±0.05 0.99±0.03 1.543＜0.001 Groups miR-NC miR-181a-2-3p t P CASC7-WT 1.03±0.06 0.37±0.051）25.351＜0.001

表4 过表达 CASC7 对 miR-181a-2-3p 表达的影响（，n=9）Tab.4 Effect of overexpressing CASC7 on expression of miR-181a-2-3p（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05.

miR-181a-2-3p 1.05±0.03 0.25±0.021）66.564＜0.001 pcDNA pcDNA-CASC7 t P 1.03±0.05 2.90±0.141）37.737＜0.001 GroupsCASC7

图2 CASC7与miR-181a-2-3p的核苷酸序列的结合位点Fig.2 Binding site of CASC7 and miR-181a-2-3p nucleo⁃tide sequence

2.4 CASC7负调控miR-181a-2-3p对细胞增殖和凋亡的影响与pcDNA 组比较，pcDNA-CASC7 组细胞OD 值降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。与pcDNA-CASC7+miR-NC 组比较，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p 组细胞OD 值升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05）。对照组与pcDNA 组比较及pcDNACASC7 组与pcDNA-CASC7+miR-NC 组比较细胞OD值和凋亡差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3和表5。

表5 各组细胞OD值和凋亡率（，n=9）Tab.5 OD value and apoptosis rate of each group of cells（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with pcDNACASC7+miR-NC group，2）P＜0.05.

Groups OD490 nm Apoptosis rate（%）2.42±0.32 2.60±0.41 29.15±3.771）27.85±3.39 6.04±0.742）317.275＜0.001 Control pcDNA pcDNA-CASC7 pcDNA-CASC7+miR-NC pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p F P 0.61±0.05 0.63±0.06 0.35±0.051）0.32±0.03 0.56±0.042）88.500＜0.001

图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡Fig.3 Flow cytometry detection of apoptosis in each group

2.5 CASC7负调控miR-181a-2-3p对细胞迁移和侵袭的影响与pcDNA 组比较，pcDNA-CASC7 组细胞迁移和侵袭数降低（P＜0.05）。与 pcDNACASC7+miR-NC 组比较，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p 组细胞迁移和侵袭数升高（P＜0.05）。对照组与pcDNA 组比较及pcDNA-CASC7 组与pcDNACASC7+miR-NC组比较细胞迁移和侵袭数差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图4和表6。

表6 各组细胞迁移和侵袭数（，n=9）Tab.6 Number of cell migration and invasion in each group（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with pcDNACASC7+miR-NC group，2）P＜0.05.

Number of invasion cells 84.89±6.69 84.44±5.79 36.56±2.911）34.33±2.67 78.44±3.242）290.545＜0.001 Groups Control pcDNA pcDNA-CASC7 pcDNA-CASC7+miR-NC pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p F P Number of migrating cells 110.78±7.57 113.44±6.11 58.44±5.041）58.11±4.15 97.67±6.222）193.501＜0.001

图4 Transwell检测各组细胞迁移和侵袭（×200）Fig.4 Transwell detects cell migration and invasion in each group（×200）

2.6 CASC7 负调控 miR-181a-2-3p 对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响与pcDNA 组比较，pcDNA-CASC7 组细胞中 CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平降低（P＜0.05），cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05）。与pcDNA-CASC7+miRNC 组比较，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p组细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高（P＜0.05），cleaved-caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05）。对照组与 pcDNA 组及 pcDNA-CASC7 组与 pcDNA-CASC7+miR-NC 组比较细胞中CyclinD1、cleaved-caspases-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组细胞中 CyclinD1、cleaved-caspase-3、MMP-2 和MMP-9蛋白表达水平Fig.5 Protein expression levels of CyclinD1，cleaved-cas⁃pase-3，MMP-2 and MMP-9 in each group of cells

3 讨论

作为近年来新发现的一种lncRNA，CASC7在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。研究显示，CASC7 低表达的神经胶质瘤患者预后不良，过表达CASC7 可抑制Wnt/β-catenin 信号通路降低神经胶质瘤细胞增殖能力并诱导细胞凋亡［8］；上调CASC7可靶向下调miR-10a抑制神经母细胞瘤细胞增殖［9］。但目前，CASC7 对NSCLC 发生发展的影响机制还未知。

本研究显示，NSCLC 癌组织中CASC7 的表达明显低于癌旁组织，过表达CASC7 抑制了A549 细胞增殖、迁移和侵袭，且诱导了A549 细胞凋亡，说明CASC7 在NSCLC 的发生和发展中也发挥抑癌基因作用，可作为NSCLC 治疗的分子靶点。CyclinD1 参与调控细胞周期，其表达增加促进细胞增殖。Caspase家族是一组天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡途径中起核心作用［10-11］。caspase-3是Caspase家族的关键调控分子，其活化后可直接切割细胞内蛋白底物，诱导细胞凋亡［12］。MMP-2 和MMP-9 可降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭［13-14］。本研究显示，过表达CASC7 降低了A549细胞中 CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达，而促进了化的caspase-3 蛋白表达，与相关报道结果一致，进一步表明过表达CASC7 抑制了A549 细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡［15-16］。

生物信息学在线软件预测显示，CASC7 可能靶向结合miR-181a-2-3p。本研究利用双荧光素酶报告基因实验证实了CASC7 可与miR-181a-2-3p 靶向结合，且过表达CASC7 抑制了A549 细胞中miR-181a-2-3p的表达，进一步说明了CASC7靶向负调空miR-181a-2-3p 表达，这与 NSCLC 组织中 CASC7 与miR-181a-2-3p 的表达呈负相关一致。有报道称，甲状腺癌中miR-181a-2-3p 的表达升高，且miR-181a-2-3p高表达的患者预后不佳［17］。本研究还显示，下调miR-181a-2-3p 表达逆转了过表达 CASC7 对 A549 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用，提示过表达CASC7 通过靶向负调控miR-181a-2-3p来抑制A549 细胞增殖、迁移和侵袭及诱导细胞凋亡。

综上所述，NSCLC 组织中CASC7 表达降低，而miR-181a-2-3p 表达升高，两者呈负相关；过表达CASC7 可靶向负调控miR-181a-2-3p 有效降低NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且促进细胞凋亡，CASC7/miR-181a-2-3p 轴可能为 NSCLC 的靶向分子治疗提供了新靶点。本研究尚存在不足之处，接下来将进一步探究miR-181a-2-3p的下游靶基因和信号通路在NSCLC 发生发展中的作用及通过动物实验在体内验证CASC7/miR-181a-2-3p 轴对NSCLC发生发展的影响。