滇重楼不同加工工艺研究

王 毓， 辛佳奇， 李红网， 张如意，*叶 霄， 沈昱翔， 尹存平， 杨继丞， 李松蔓

（1. 安顺学院农学院， 贵州 安顺 561000；2. 四川省农业科学院 经济作物育种栽培研究所， 四川 成都 610300； 3. 成都医学院， 四川 成都 610500）

0 引言

滇重楼（ Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mass.） 为 黑 药 花 科 重 楼 属（ Paris）植物， 自然分布于我国云贵川三省[1-2]。 滇重楼是历版《 中国药典》 收录著名药用植物， 具有抗肿瘤、消肿止痛、 止血、 抗菌消炎和免疫调节等作用[1，3]，甾体皂苷是其发挥药理作用的主要物质基础[4]， 关于重楼药材的质量评价大多从此类物质展开[5]。 但大多研究主要集中在重楼栽培技术与品质评价方面， 如李海涛等人[6]研究表明不同产地对滇重楼品质的影响； 杨骁、 陈翠、 何忠俊等人[7-12]研究结果表明栽培方式、 海拔、 土壤等因素对于滇重楼有效成分含量及质量的影响； 周浓、 张静、 等人[13-15]研究结果表明不同干燥方式对薯蓣皂苷或总皂苷的含量影响， 但目前可查文献资料缺乏对于不同加工方法影响重楼皂苷I、 重楼皂苷II、 重楼皂苷VII， 以及总黄酮等有效成分含量的对比研究， 关于加工方法对于重楼品质的相关研究报道仍不完善， 运用冻干法对滇重楼此类成分进行系统研究的报道则更为少见。 杨天梅等人[16]试验研究表明滇重楼沸水处理、 烘箱干燥加工总皂苷含量高于其他方法， 得出加工炮制一体化为重楼最佳加工方法的结论， 试验综合前期研究，采用趁鲜切片方法处理滇重楼， 并在其烘箱干燥处理中增加了不同温度加工处理， 且与冻干法加工数值进行对比， 以期为滇重楼质量研究提供参考材料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器为Agilent 1200 型高效液相色谱仪， G1314B型VWD 检测器， Agilent Chemstation 化学工作站， 美国安捷伦公司产品； YTLG-10A 型真空冷冻干燥机；hh-38 型恒温水浴锅； Ax124ZH/E 型电子天平；UV-5200PC 型紫外可见分光光度计； 800Y 型打粉机； EPED-E3L-20TJ 型蒸馏水器等。

试药为蒸馏水、 三氯化铝固体、 高氯酸（70%～72%） 、 90%乙醇（ 分析纯） 、 甲醇（ 分析纯） 、 乙腈（ 色谱纯） 、 浓硫酸（ 分析 纯） 、 蒽酮（ 分析纯） ，（批号20180111）， 国药集团化学试剂有限公司提供；芦丁对照品（ 批号R106912） ， 上海阿拉丁试剂有限公司提供； 葡萄糖对照品（ 批号G116305） ， 上海阿拉丁试剂有限公司提供； 3 种重楼皂苷对照品购自中国食品药品鉴定研究院： 重楼皂苷I（ 批号：111590-201604） ， 重 楼 皂 苷II（ 批 号： 111591-201604）， 重楼皂苷VII（批号： 111593-20160）。

1.2 样品来源

试验样品购于安顺地区种植户， 均为为无性繁殖法栽培3 年， 经安顺学院沈昱翔副教授鉴定为黑药花科植物滇重楼（Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.) Hand.-Mass.） 的根状茎。 选择大小、生长状况接近的个体， 以保证试验结果的代表性。

1.3 滇重楼药材加工方法

将选取好的滇重楼样品的块茎洗净、 晾干， 去掉须根， 均切成1 cm 厚度， 混匀， 随机分成质量相近的6 份， 采用以下各项加工方法进行干燥处理至恒重（ 见表1） ， 并计算滇重楼折干率（ 结果见表2） 。 ①自然干燥法： 将处理好的滇重楼置于室内通风干燥处阴干至恒定质量（CK）； ②烘干法： 将处理好的滇重楼分别于35 ℃（ 处理代码S1， 下同） 、 55 ℃（S2） 、 75 ℃（S3） 、 95 ℃（S4） 进行烘干至恒质量，得到不同温度烘干的加工品； ③冻干法： 将处理好的滇重楼置于YTLG-10A 型真空冷冻干燥机中冷冻干燥制得加工品（S6）。

滇重楼根状茎不同处理方法见表1。

表1 滇重楼根状茎不同处理方法

1.4 滇重楼药材性状特征及折干率评价方法

折干率计算公式为：

药材性状评价参照2020 年版《 中国药典》 I 部重楼药材标准“ 形状” 项下药材性状进行描述。回流提取采用索氏提取法。

1.5 3 种特殊皂苷含量测定

测定方法参照2020 年版《 中国药典》 I 部中重楼药材标准里面的“ 含量测定” 对滇重楼药材3 种特殊重楼皂苷总和含量测定。

色谱条件： 依利特C18柱（ Sinochrom ODS-BP，4.6 mm×200 mm， 5 μm） ； 检测波长203 nm； 柱温30 ℃； 以乙腈为流动相A， 以水为流动相B 进行梯度 洗 脱（ 0～40 min， 30%～60%A， 70%～40%B；40～50 min， 60%～30%A， 40%～70%B） 。 检测波长为203 nm， 进样量10 μL， 流速0.8 ml/min。

对照品溶液的制备： 精密称取对照品重楼皂苷I 4.4 mg， 重楼皂苷II 4.0 mg， 重楼皂苷VII 3.9 mg， 置50 mL 量瓶中， 加甲醇制成含重楼皂苷I 0.44 mg/mL，重楼皂苷II 0.40 mg/mL， 重楼皂苷VII 0.39 mg/mL的对照品贮备液。 精密量取4 种对照品贮备液各2.5 mL置10 mL量瓶中， 摇匀， 用0.45 μm 微孔滤膜滤过即得混合对照品溶液。

制备样品溶液并测定： 取样品粉末约0.5 g， 精密称量， 置具塞锥形瓶中， 精密加入乙醇25 mL， 称定质量， 加热回流30 min， 放冷， 再称定质量用乙醇补足减失的质量， 摇匀滤过， 即得。 分别精密吸取供试品溶液10 μL， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。

3 种重楼皂苷线性范围考查： 重楼皂苷I： 回归方程为Y=335.982 2X+5.568 8， 线性范围为0.157 0～1.569 0 μg， r=0.999 8； 重楼皂苷II： 回归方程为Y=328.435 3X+6.231 1， 线性范围为0.164 6～1.665 μg，r=0.999 9； 重楼皂苷VII： 回归方程为Y=272.246 3X+5.227 9， 线性范围为0.181 2～1.812 0 μg， r=0.999 7。

精密度试验： 精密吸取对照品溶液10 μL， 注入液相色谱仪， 测定峰面积， 重复6 次， 重楼皂苷I、II、 VII 的峰面积RSD 分别为0.97%， 0.99%， 0.94%（n=6）。 通过试验表明仪器的精密度良好。

稳定性试验： 取同一供试品滇重楼溶液， 室温密闭放置， 分别在制备后0， 2， 4， 8， 12 h 分别进样10 μL， 测定重楼皂苷峰面积。 测得后计算重楼皂苷I、 II、 VII 峰面积RSD 分别为0.68%， 0.73%，0.49% （ n=5） 。 通过试验表明， 供试品溶液在12 h内检测对结果无影响， 供试品溶液稳定性良好。

重复性试验： 取同一样品滇重楼6 份， 分别按照供试品溶液的制备方法制备， 分别进样10 μL， 测定峰面积， 计算含量。 重楼皂苷I、 II、 VII 含量的RSD 分别为0.62%， 0.98%， 0.79% （ n=6） 。 通过试验表明该方法重现性良好。

加样回收率试验： 取6 份已知含量的滇重楼样品，每份0.25 g， 精密称定。 分别加入对照品溶液2 mL。按照供试品溶液的制备方法制备， 进样10 μL， 测定峰面积， 计算回收率。 重楼皂苷I、 II、 VII 的平均回收率分别为100.25%， 100.51%， 94.11%， 重楼皂苷I、 II、 VII 的回收率的RSD 分别为1.70%， 1.88%，1.44%。 试验表明该方法测定含量精确性较好。

1.6 总黄酮含量测定

制备标准曲线： 精确称取芦丁对照品适量， 于25 mL 容量瓶中， 甲醇溶解定容， 得质量浓度为0.1 mg/mL 的溶液。 取上述溶液0， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0，2.5 mL 分别于6 个10 mL 容量瓶中， AlCl3显色剂定容， 于波长425 nm 处测吸光度， 以吸光度为纵坐标制作标准曲线， 得回归方程Y=33.78X+0.026 9，R2=0.999 3。

制备样品溶液并测定： 精确称取样品粉末1.5 g，圆底烧瓶内加甲醇90 mL， 80 ℃水浴锅中回流提取2 h， 静置至室温， 过滤， 重复回流一次， 过滤， 合并2 次滤液。 加热挥发至干， 甲醇溶解残渣转移至10 mL 容量瓶中， 即得样品液。 取样品液2 mL 于10 mL 量 瓶 中， AlCl3溶 液 定 容， 混 匀 后 于 波 长425 nm 处测吸光度， 计算样品中总黄酮含量。

1.7 可溶性多糖含量测定

制备标准曲线： 精确称取葡萄糖对照品适量于25 mL 容量瓶中， 双蒸水定容得质量浓度为0.1 mg/mL的溶液。 取对照品溶液0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mL分别于6 个10 mL 具塞试管中， 加蒸馏水补至2 mL，置于冰水中加硫酸- 蒽酮溶液6 mL， 摇匀。 100 ℃沸水浴中显色15 min， 冷却后定容至刻度， 以2 mL蒸馏水重复处理作为空白对照， 于波长625 nm 处测定吸光度， 以吸光度为纵坐标制备标准曲线， 得到回归方程Y=14.965X+0.145 4， R2=0.999 6。

制备样品溶液并测定： 精确称取样品粉末0.5 g，于已烘干锥形瓶中， 加12 mL 蒸馏水， 加6 mol/L HCl 溶液10 mL， 100 ℃水浴30 min， 玻棒搅匀， 冷却后用10%NaOH 溶液中和至中性， 定容至100 mL，过滤， 取滤液10 mL， 再次定容至100 mL 即得样品水解液。 取样品液1 mL， 于试管中， 冰水状态下缓慢加入硫酸蒽酮溶液4 mL， 100 ℃下水浴10 min，冷却后于波长625 nm 处测吸光度， 计算样品中可溶性多糖含量。

2 结果与分析

不同干燥处理后滇重楼样品内有效成分含量见表2。

由表2 可知， 不同干燥处理方法对滇重楼样品内有效成分含量有一定影响。 对于折干率而言， 冻干法最高， 为57.86%。 其后折干率由大到小依次为35 ℃下烘干（ 折干率为46.27%） 、 75℃下烘干（ 折干率为45.65%）、 自然干燥（折干率为44.22%）、 95 ℃下烘干（ 折干率为41.66%） 、 55 ℃下烘干（ 折干率为39.33%） 。 重楼皂苷I、 II 含量及3 种特殊皂苷含量和均为趁鲜切片95 ℃烘干的样品最高， 且随温度的降低而降低， 冻干法含量居中， 自然干燥法含量最低； 该结果与杨天梅等人[16]沸水处理皂苷含量最高的实验结果类似， 推测可能由于高温快速破坏滇重楼根茎中的酶， 并杀死植物细胞， 避免了有效成分的分解、 代谢， 同时使其淀粉糊化、 结晶水迅速散失， 因此皂苷含量最高。 总黄酮含量55 ℃条件下最高， 自然干燥法最低， 其余加工方法含量由大到小依次为35 ℃＞冻干法＞95 ℃＞75 ℃； 可溶性多糖含量75 ℃条件下最高， 冻干法最低。

因此， 滇重楼产地趁鲜切片后95 ℃快速烘干是最为方便快捷、 且药材品质优良的加工方法。 但是因为高温烘烤， 导致重楼药材质地呈胶质， 与传统药材商品分级习惯不符。 建议生产中结合实际情况采用95 ℃快速烘干法， 可以提高重楼药材的质量。