番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子标记及检测

王涛，张子君，张逸鸣，王晓峰，邹庆道

（辽宁省农业科学院蔬菜研究所，辽宁沈阳 110161）

番茄斑萎病毒（TSWV）是一种极具破坏性的农作物病毒病原，威胁着全世界的番茄生产。TSWV 是番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的一种RNA 病毒，属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）。番茄感染TSWV 后茎和叶片发育不良，叶片呈青铜色、卷曲、出现坏死斑点和条纹，产量也随之大幅度减少甚至绝收。TSWV的传播媒介主要是西花蓟马，媒介一旦获毒便终生带毒，带毒的成年蓟马感染一棵健康的植株只需30 min[1-2]。由于TSWV的寄主范围较广，包含了84 个科1 090 种植物[3]，目前还没有有效的防控措施。

培育抗病番茄新品种是预防TSWV 最直接有效的方法，研究者在栽培番茄和野生番茄中均发现有TSWV的抗源。迄今为止，已报道的抗病基因有8 个，包括Sw1a，Sw1b，sw2，sw3，sw4，Sw-5，Sw-6 和Sw-7[4-5]，其中只有在秘鲁番茄中发现的Sw-5 基因广泛应用在番茄育种中。Sw-5对TSWV的各种小种均表现出较好的抗性，并且对番茄斑萎病毒属的其他病毒也具有抵抗作用。携带Sw-5的植株可以有效地限制TSWV的扩散，仅在局部位置出现轻微过敏性症状。研究者利用RFLP 分子标记将Sw-5 定位在第9 染色体临近端粒区域的长臂上，位于标记CT71 和CT220 之间[6]。随后Spassova 等[7]利用图位克隆法克隆了该基因，Sw-5 和其他许多抗性基因一样，属于CC-（NB-ARC）-LRR 结构。此外，研究者还发现Sw-5 基因有5 个连锁的拷贝序列（Sw-5a-Sw-5e），通过转基因验证，单独Sw-5b 同样具有抗病性。Dianese 等利用Sw-5 序列的一个InDel 突变，开发出一个共显性CAPS 标记，该标记的扩增子包含了Sw-5b 启动子的一段保守序列[8]。Lee 等利用Sw-5b的DNA序列，开发了一个SNP 标记，可以用于鉴定抗感番茄材料[2]。该研究对获得的1 个连锁标记进行验证和体系优化，建立稳定可靠的番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子标记鉴定技术体系，为番茄斑萎病毒病抗病育种提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地概况。试验设置于辽宁省农业科学院蔬菜研究所沈阳试验基地，位于123°55′E、41°82′N，海拔50 m，温带半湿润大陆性气候，全年平均气温8.6℃。试验在连栋大棚中进行，单棚长45 m，宽6 m，脊高3.5 m，钢架结构，棚膜为聚乙烯无滴膜。大棚内土质为壤土，肥力均匀，灌溉采用地膜下滴灌。

1.1.2 试验材料及试剂。试验材料为42 份番茄，包括引进的抗斑萎病毒病自交系（Sw-5/Sw-5）3 份，分别为RE1、RE2、RE3；辽宁省农业科学院蔬菜研究所番茄课题组培育的自交系（感病）3 份，分别为SU1、SU2、SU3；F1杂交种8 份，均来自辽宁园艺种苗有限公司，编号为L1-L8；F2代单株28 份（L9-L36），为性状优良的抗病F1杂交种（L3）的分离后代。所有供试材料于2020 年3 月播种，4 月底定植于连栋大棚中。

主要试剂包括：500 mmol/L NaOH 溶液，100 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0），10 μmol/L 上下游引物，10×PCR buffer，10 mmol/L dNTP，0.5 U/μL Taq 酶（天根），6×Loading buffer，1×TBE，goodview（赛百盛），琼脂糖（Biowest）。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取。采用碱解法提取番茄幼苗期叶片DNA，取20 mg 叶片放入2.0 mL 管，加入200 μL NaOH 溶液，在研磨机上研磨2 min，静置片刻，13 000 rpm 离心3 min，取上清液转入新的离心管中，加入100 μL Tris-HCl，4℃保存备用。

1.2.2 引物获得与合成。Sw-5 基因的连锁分子标记按照Dianese 等[8]设计的CAPS 标记，引物序列（表1）完全按照文献所提供，并无改动，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成。

表1 抗病基因的引物序列

1.2.3 PCR 扩增体系。通过体系优化，最终确定引物的PCR 反应总体系为10 μL，包含DNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，10×buffer 1 μL，dNTP 0.25 μL，Taq 酶1U，ddH2O 补足10 μL。PCR 扩增在德国耶拿PCR 仪上进行，反应程序分为3 步，第1 步：94℃预变性5 min；第2 步：94℃变性30 s，54.5℃复性45 s，72℃延伸30 s，35 个循环；第3 步：72℃延伸10 min。PCR 产物加入6×Loading buffer，然后在电泳仪上进行电泳检测。琼脂糖凝胶的浓度为3%，goodview 染色，固定电压120V，电泳时间为20 min，然后将琼脂糖凝胶取出，在BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统下进行拍照。

2 结果与分析

2.1 Sw-5 连锁标记的获得

利用特异引物首先对3 份抗病材料和3 份感病材料进行PCR 扩增，从图1 可以看出，3 份抗病材料RE1、RE2、RE3 均扩增出574 bp的特异条带，3 份感病材料SU1、SU2、SU3 均扩增出464 bp的条带。说明该标记为共显性标记，含有Sw-5 基因的抗病番茄可以扩增出574 bp的条带，不含有Sw-5 基因的感病番茄可以扩增出464 bp的条带。

图1 3 份抗病和3 份感病材料的PCR 扩增

2.2 F1 杂交种的PCR 检测

利用特异引物对8 份F1杂交种进行PCR 扩增，结果显示，5 份番茄扩增出574 bp 和464 bp 两条带，分别为L1、L3、L4、L5 和L6，说明这些材料携带有杂合抗病基因（Sw-5/sw-5），L8 扩增出574 bp 一条带，说明该材料携带纯合抗病基因（Sw-5/Sw-5），L2 和L7 扩增出464 bp 一条带，说明这2 份材料不含有Sw-5 基因。

图2 8 份F1 材料的PCR 扩增

图3 28 份F2 材料的PCR 扩增

2.3 分离材料的PCR 检测

对28 份F2代分离材料进行鉴定，结果显示，共获得抗病材料20 份，其中有6 份（L14、L15、L19、L20、L21 和L25）扩增出574 bp 特异性条带，为纯合抗病材料；有14份（L9、L12、L16、L18、L23、L24、L26、L29、L30、L31、L32、L33、L34 和L36）扩增出574 bp 和464 bp 两条带，为杂合抗病材料。其余8 份不含Sw-5 抗病基因。

3 讨论

将Sw-5 基因的连锁分子标记应用在育种实践中，将极大地提高抗TSWV 番茄试材的鉴定效率，对于番茄育种材料的遗传改良和新品种培育都具有重要价值。随着Sw-5 基因的克隆，研究者开发了一些该基因的分子标记。Shi 等[9]根据Sw-5的DNA 序列开发了一个功能性标记，该标记为显性标记，无法区分杂合个体。Lee 等[2]等根据一个SNP 突变，设计了一对SNP 引物，通过高效溶解曲线可以鉴定抗感番茄材料，然而该方法需要荧光定量PCR，对实验条件要求较高，且药品费用昂贵。该文选择了一个共显性SCAR 标记，通过验证，真实可靠，可以在抗病和感病番茄材料中扩增出清晰的特异性条带，且长度差异明显，很容易区分抗感带型。SCAR 标记操作简单，不需要酶切等其他试验操作，技术成熟且费用低，因此该标记完全可用于番茄抗TSWV 育种材料的鉴定和筛选。

根据Dianese 等[8]报道，该SCAR 标记可以在含有Sw-5基因的番茄材料上扩增出574 bp 条带，不含Sw-5 基因的材料上扩增出510 bp 或464 bp 条带。该文未扩增出510 bp 条带，其原因可能是该研究选择的番茄材料有限，未能覆盖该标记的所有等位基因。

该文对市场上购买的8 份抗TSWV 杂交种进行PCR检测，发现其中6 份与预期结果一致，其余2 份并未检测出Sw-5 基因，这2 份材料可能含有其他抗TSWV 基因，或者植株长势较强，对TSWV 具有一定的耐性。该研究从28份分离材料中筛选出20 份含有Sw-5 基因的单株，通过田间自然发病，这些单株均表现出较好的抗病性，然而这些材料的其他农艺性状不是十分理想，例如果实偏小，不抗其他病害等。因此需要扩大番茄材料的筛选范围，同时利用上述SCAR 标记辅助选择，进行回交转育，将Sw-5 基因导入到综合性状优良的核心育种系中，为培育品质优良多抗的番茄新品种奠定基础。