肌联蛋白titin介导抗阻和有氧运动对糖尿病性心肌舒张功能障碍的不同影响

2021-11-25李顺昌高德润IsmailLaher苏全生

中国体育科技 2021年11期

李顺昌，高德润，Ismail Laher，苏全生

糖尿病患者半数以上的致病/致死原因都与其心血管并发症有关（Rydén et al.，2013），且长期服用调节血糖代谢药物可进一步增加心血管疾病的风险，这可能与特定药物的直接副作用或改变机体代谢（通常是低血糖）引起的间接副作用有关（Triggle et al.，2014）。因此，即使接受正规专业治疗，糖尿病患者心血管疾病患病风险仍大大增加。大量研究证实，糖尿病患者早期心肌功能已出现明显损伤，且主要以舒张功能减弱为主，收缩功能往往表现为正常（Brunvand et al.，2016；Goyal et al.，2013；Maximilian et al.，2016；Schannwell et al.，2002；Yilmaz et al.，2015）。肌联蛋白（titin）是从Z盘至M线贯穿半个肌节的巨大蛋白，提供弹簧样回弹作用，使肌节在收缩后恢复至初始长度，保证肌节内张力传递（Lewinter et al.，2014）。有研究指出，titin蛋白表达减少是糖尿病心肌病发生的主要原因之一（Hsu et al.，1997）。

运动疗法是糖尿病临床治疗策略的重要组成部分。运动可明显降低糖尿病患者心肌细胞内脂质含量，上调肌浆网钙调蛋白，减轻心肌细胞凋亡，改善氧化应激反应，维持心肌正常的结构和功能（Li et al.，2015，2016）。不同运动方式对心脏施加的刺激不同。根据摩根罗斯理论，有氧运动导致外周血管阻力进行性下降和静脉回心血量增加，出现明显的容量过载，左心室舒张末期容积增加而表现为心肌“前负荷”增加；抗阻运动导致外周血管阻力短时间内急剧增加，出现明显的压力过载而表现为“后负荷”增加（D’Andrea et al.，2015；Morganroth et al.，1975）。据此我们推测，抗阻和有氧运动对糖尿病性心肌舒张功能障碍的影响可能会表现出明显差异。因此，本研究在建立糖尿病大鼠心肌舒张功能障碍模型的基础上，对比抗阻和有氧运动对心肌舒张功能的不同影响，探讨肌联蛋白titin在不同运动干预心肌功能中的作用。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只（6周龄，体质量200～220 g，SPF级），由成都达硕实验动物有限公司提供，饲养于成都体育学院运动医学与健康研究所动物房，标准啮齿目动物饲养笼分笼饲养，饮食饮水自由摄取，控制室温21℃～23℃，相对湿度40%～60%，12：12 h明暗循环，并保证良好通风。动物饲养及处理方案经成都体育学院实验动物伦理委员会审核通过。

1.2 动物模型及运动干预方案

1.2.1 动物造模及分组

SD大鼠随机分为预对照组（pre-Control，pC；n=30）和预模型组（pre-Diabetes，pD；n=50）。pC组喂食普通啮齿类实验动物饲料。参照Stalin等（2016）研究，pD组喂食高糖高脂饲料，第8周尾静脉取血测试空腹血糖（FBG）和胰岛素（FINS）判断胰岛素抵抗情况，随后对胰岛素抵抗大鼠进行小剂量链脲佐菌素（STZ，30 m/kg）腹腔注射，并于72 h后尾静脉取血测试非禁食血糖，参照2型糖尿病大鼠模型常用判断指标“胰岛素抵抗基础上血糖≥16.7 mmolL”（Elias et al.，1994），成功造模2型糖尿病大鼠36只。pC组大鼠于相同时间进行相同剂量枸橼酸缓冲液腹腔注射。

造模成功后，从pD组中选取30只糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组（Diabetic control，D，n=10）、糖尿病有氧干预组（Diabetic aerobic exercised，DA，n=10）和糖尿病抗阻运动干预组（Diabetic resistance exercised，DR，n=10）。pC组随机分为空白对照组（Control，C，n=10）、有氧运动对照组（Control aerobic exercised，A，n=10）、抗阻运动对照组（Control resistance exercised，R，n=10）。

1.2.2 实验动物饲料

普通饲料：5%脂肪、50%碳水化合物和23%蛋白质，总能量约为3 000 kcal/kg；高脂高糖大鼠饲料：67%基础饲料、10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇和1%胆酸钠，总能量约为 6 000 kcal/kg（Epp et al.，2013）。饲料均由成都达硕实验动物有限公司提供。

1.2.3 运动干预方案

有氧运动方案：小动物电动跑台（DSPT-208，杭州段氏）用于大鼠有氧运动训练。参照Bedford运动模型（Bedford et al.，1979），适应性运动3天后，A和DA组大鼠以20 m/min（60%～70%V.O2max）、60 min/天、5 天/周进行训练，共8周。运动过程中使用电刺激和毛刷刺激大鼠尾部以维持其运动。

抗阻运动方案：小动物爬梯（成都体育学院运动医学与健康研究所自制）用于大鼠抗阻运动训练。爬梯高1 m，每级阶梯间隔2 cm，训练时倾斜85°放置。适应性无负重爬梯训练3天，必要时使用毛刷刺激大鼠尾部以促使其运动。正式训练前测试最大负重（1 RM）：参照Hornerberger大鼠抗阻模型（Hornberger et al.，2004），R 和 DR组大鼠最初以尾部负重75%体质量爬梯，后每次增加30 g负重直至完全不能或不能完全完成爬梯，每周重新测试1 RM。正式抗阻训练时，大鼠被置于爬梯底部，尾部分别负重50%、75%、90%、100%1 RM，每一个负重级别爬行3次，100%1 RM负重时，如不能完成3次者以实际运动能力为限（≤3次），到达顶部后休息2 min重复上述运动，5天/周，共训练8周。

1.3 指标采集与检测分析

1.3.1 血流动力学指标

1.3.1.1 麻醉和手术

戊巴比妥钠（1%，65 mg/kg）腹腔注射麻醉后，大鼠仰卧位固定于恒温手术台上，备皮，沿颈部皮肤正中线切开5～7 cm，钝性分离，暴露右侧颈动脉2～3 cm，穿双线备用。结扎颈总动脉远心端，用动脉夹夹闭近心端。在结扎处用眼科剪斜剪一个朝向心脏方向的V形切口，触摸大鼠胸前心尖波动最明显处，测量此点与右颈总动脉V形切口之间的距离，并在EP50导管上标记相应的距离，以便确定推进导管的最大深度。导管内灌注肝素（5 u/ml），排尽气泡，连接压力换能器，信号输入PowerLab数据采集和分析系统。

1.3.1.2 插管和数据采集

导管从右颈总动脉切口沿向心方向缓缓插入，松开动脉夹后出现动脉波；缓缓推动导管并密切观察电脑上显示的动脉压波形，当插管进至主动脉瓣开口时，可以感觉到明显的阻力，在心脏收缩瞬间旋转导管进入左心室，体会明显的“落空感”，出现特征性左心室压力波形；近心端备用线打结固定导管。心脏血流动力学指标通过AD Labchart数据分析系统进行采集、处理和分析。

1.3.2 免疫荧光

剪取约3 mm×3 mm×5 mm大小的左室心肌，平整放入已加一半OCT的包埋盒中，整理肌纤维走向、形状及位置，其上用OCT填满包埋盒，放入冰箱内冷冻，待OCT凝固后放入液氮内速冻。常规冰冻切片，95%酒精后固定，将切片置于封闭液中，室温1 h；用PBST按1：200稀释titin抗体（9D10，Hybridoma Bank），4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次10 min；用PBST按1：1 000稀释二抗（FITC-conjugated IgG 1：400，Rockland），室温避光孵育 1～2 h；PBS清洗3次，每次10 min。倒置荧光显微镜（BS53，Olympus）下观察采图，结果图形应用Image Pro Plus Version 6.0图像分析软件测量分析。

1.4 数据处理

所用数据均以平均值±标准差（M±SD）表示。数据统计使用SPSS 22.0统计软件包和Graphpad Prism 6进行处理。各组间比较采用双因素方差（Two-way ANOVA）分析，用Tukey法进行各组均值多重比较。显著性差异标准P＜0.05，非常显著性差异标准P＜0.01。

2 结果

2.1 血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数

与C组比较，A组大鼠体质量虽略有下降但无统计学意义（P＞0.05）；R组则明显高于C组（P＜0.05）；D组体质量出现明显下降（P＜0.01），DA和DR组大鼠体质量较D组均明显升高（P＜0.05），但两组之间无统计学差异（P＞0.05；图1）。

图1 8周抗阻和有氧运动干预后各组大鼠体质量（A）、空腹血糖（B）、血胰岛素（C）和胰岛素抵抗指数（D）变化情况Figure 1. Body Weight（A），Fasting blood Glucose（B），Fasting Insulin（C）and HOMA-IR（D）after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise

C、A、R各组大鼠间血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数均无明显差异（P＞0.05）；D组血糖升高非常明显（P＜0.01），胰岛素水平明显下降（P＜0.01），胰岛素抵抗指数大幅升高（P＜0.01）；与D组相比，DA和DR组大鼠胰岛素水平明显升高（P＜0.05），空腹血糖和胰岛素抵抗指数均显著降低（P＜0.05），且DR组大鼠空腹血糖下降幅度明显大于DA组（P＜0.05；图1）。

2.2 心脏功能

心肌收缩功能相关指标中，左心室内压最大上升速率（Max dp/dt），C、A、D、DA和DR各组大鼠之间无显著性差异（P＞0.05），R组较 C组有明显升高（P＜0.01；图2）。

心肌舒张功能相关指标中，与C组相比，A组大鼠左心室舒张末压（LVEDP）明显下降（P＜0.05）；D组左心室松弛时间常数（Tau）和LVEDP均明显增大（P＜0.01），左心室内压最大下降速率（Min dp/dt）显著下降（P＜0.01）（图2）。与D组相比，DA组大鼠LVEDP明显升高（P＜0.05），Tau值明显减小（P＜0.05），已接近C组（P＞0.05）；而DR组LVEDP与D组近似（P＞0.05），其明显低于DA 组大鼠（P＜0.05；图2）。

图2 8周抗阻和有氧运动干预后各组大鼠心肌舒缩功能相关指标的变化情况Figure 2. Cardiac Function after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise

2.3 心肌肌联蛋白titin表达情况

Titin主要分布在肌纤维中，呈现出明暗相间的横纹。C组大鼠左室心肌titin以规律的明暗相间横纹分布于整个肌纤维，横纹清晰，荧光着色较深；A、R组和C组基本相似，横纹结构清晰，荧光染色较淡；D组大鼠心肌titin荧光染色变淡现象明显增多，有些部位出现明显的缺染现象；DA组大鼠心肌titin缺染区域明显减少，染色深度较强，横纹结构清晰可见；DR组大鼠心肌titin缺染最为严重，横纹结构也较模糊（图3）。

图3 8周抗阻和有氧运动干预后各组大鼠心肌titin免疫荧光标记情况（比例尺=50 μm）Figure 3. Immunofluorescence of Titin after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise（Scale bar=50 μm）

Titin蛋白经免疫荧光染色，倒置荧光显微镜采图后，用Image Pro Plus 6.0图像软件进行处理分析（图4）。与C组相比，A组大鼠心肌titin平均荧光强度（OD值）未表现出明显差异（P＞0.05），而R组OD值下降明显（P＜0.05），D组OD值也出现非常显著性下降（P＜0.01）。与D组相比，DA组大鼠心肌titin OD值明显上升（P＜0.05），已接近正常水平（P＞0.05 vs C），DR组OD值却出现进一步下降（P＜0.05）。

图4 8周抗阻和有氧运动干预后各组大鼠心肌titin平均荧光强度（OD）值Figure 4. Average Titin Fluorescence Intensity Values after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise

3 讨论

糖尿病运动干预研究的重要前提是建立科学合理的2型糖尿病动物模型。目前，糖尿病动物模型主要有自发性糖尿病动物模型、转基因糖尿病动物模型和诱发性糖尿病动物模型3类（Amin et al.，2016）。其中，诱发性糖尿病动物模型是通过特定致病因素人为诱发具有糖尿病特征的动物模型，方法简便、可重复，并可在短期内诱导出大量模型。本研究对8周龄雄性SD大鼠喂养高糖高脂饲料7周后，尾静脉采血测试空腹血糖、胰岛素并计算稳态胰岛素抵抗评价指数发现，预造模组大鼠空腹血糖和胰岛素明显升高，胰岛素抵抗指数大幅提高。提示，7周高糖高脂饮食诱发了明显的胰岛素抵抗。第8周预造模组大鼠进行一次小剂量STZ（30 mg/kg）腹腔注射，观察72 h，尾静脉取血测试非禁食血糖，参照2型糖尿病大鼠模型常用判断指标“胰岛素抵抗基础上血糖≥16.7 mmol/L（Elias et al.，1994）”，结合大鼠体质量下降和“多饮、多食、多尿”等典型糖尿病临床症状，将血糖值≥16.7 mmol/L的预造模组大鼠确定为造模成功。本研究建立的糖尿病动物模型成功率为72%。

糖尿病性心脏病的病理发展大概分为两个阶段：第1阶段是心肌对糖尿病代谢改变的短暂生理适应期；第2阶段是心肌无法修复而最终积累产生不可逆的病理性重构（Fang et al.，2004）。有研究报道，STZ静脉注射诱发的糖尿病大鼠在6～14周出现明显的心功能改变，且心肌功能的损伤以舒张功能减低出现最早（Thompson，1988）。一项以40名糖尿病患者为研究对象的研究发现，所有患者收缩功能指标均正常，但在没有心血管疾病的情况下却表现出舒张功能受损（Astorri et al.，1997）。Boyer等（2004）也提出，47%血糖控制良好的2型糖尿病患者仍存在不同程度的左室舒张功能障碍。本研究采用经右颈动脉行左心室插管术评价大鼠心脏血流动力学的变化，结果显示，糖尿病8周大鼠的左心室内压最大上升速率（Max dp/dt）无明显变化，而左心室舒张末压（LVEDP）明显增大，左心室松弛时间常数（Tau）显著延长，左心室内压最大下降速率（Min dp/dt）显著下降，证实了糖尿病8周大鼠左心室收缩功能正常，舒张功能障碍。需要特别指出的是，Tau与心肌顺应性密切有关，其值越大，心肌顺应性越差。糖尿病大鼠Tau明显升高，提示左心室心肌顺应性明显下降。

运动可明显改善糖尿病心脏功能的异常（Kristian et al.，2018；Larsson et al.，2018）。Lahaye等（2014）发现，运动对糖尿病心肌的保护作用与运动负荷密切相关。因对心脏刺激的不同，抗阻和有氧运动对糖尿病心脏功能的影响应表现出差异。本研究运用在体心脏插管检测血流动力学相关指标，结果显示，有氧运动可使糖尿病大鼠LVEDP明显减小，Min dp/dt增加，且Tau显著缩短至趋于正常。提示，有氧运动可延缓糖尿病大鼠早期心肌顺应性下降，维持正常的心脏舒张功能。抗阻运动干预未表现出明显的保护作用，相反，LVEDP增大、Min dp/dt下降都有加重趋势，且Tau值明显大于糖尿病组。提示，抗阻运动使糖尿病早期大鼠心肌顺应性进一步减弱，从而加重左室舒张功能障碍。

肌联蛋白titin是维持心肌细胞张力的重要结构蛋白。研究表明，titin蛋白表达下降是心肌被动张力减弱的主要原因，各种生理和病理性因素可通过调节titin蛋白表达对心脏舒张功能起到急性或慢性的调整作用（Martina et al.，2009；Nagueh et al.，2004；Warren et al.，2003；Wu et al.，2002；Yamasaki et al.，2002）。近年来，随着生物实验技术的不断发展，titin改变在心脏舒张功能障碍中的作用引起研究者的关注，成为相关研究领域的一个热点。在扩张性心肌病、缺血性心脏病和高血压性心肌病中均已发现titin的改变（Nagueh et al.，2004；Neagoe et al.，2002；Warren et al.，2003；Wu et al.，2002），但 titin在糖尿病早期心脏舒张功能障碍中的作用的研究相对较少。Hsu等（1997）发现，2型糖尿病大鼠心脏出现舒张功能障碍时，titin蛋白表达下降；但Lehti等（2007）却提出，早期的1型糖尿病小鼠心肌细胞titin基因表达量无改变。本研究发现，糖尿病大鼠心肌titin荧光染色变淡现象明显增多，有些部位出现明显的缺染现象；进一步分析心肌titin平均荧光强度后发现，糖尿病大鼠心肌titin蛋白表达明显下降，证实糖尿病伴随着心肌titin蛋白表达下降。可能机制是：糖尿病的高血糖高血脂等病理因素诱发自由基增多、氧化应激等，导致心肌细胞凋亡和坏死，肌纤维局灶性溶解，titin作为连接Z线和M盘的模板蛋白结构出现相应损伤。有氧运动干预后，糖尿病大鼠心肌titin荧光缺染现象明显好转，平均荧光强度明显增高，而抗阻运动干预后，荧光缺染现象并未出现改善，且平均荧光强度有下降趋势。可能原因是：有氧运动使机体血液循环加快，远端毛细血管扩张，外周阻力下降，回心血量增加，心肌扩张幅度和强度增大，对骨架蛋白titin的刺激明显，因而出现明显的适应性改变；而抗阻运动由于肌肉持续性收缩导致外周阻力急剧增加，加大了心脏泵血的难度和工作量，长期的超负荷加上糖尿病高血糖、高血脂等的联合作用，最终导致心肌纤维包括titin受损。